请教人胚胎干细胞冷冻解冻问题

qiushuiwuhen

各位战友，想请教关于胚胎干细胞冷冻的相关问题，我目前的情况是：在使用有饲养层的情况下，用IV胶原酶（1mg/ml）消化干细胞10min，然后中和HES培养基，用枪轻轻吹打，最大限度保留肝细胞团块的完整性，然后用干细胞培养基：FBS：DMSO=8:2:1的比例冷冻液进行冷冻放进程序性冷冻盒中，放进 -80冰箱，第二天放进液氮中；在养feeder-free的人干细胞的时候用dispase酶(1mg/ml)消化半小时后流程同上；) U/ q/ ?6 C9 V+ Z( C( a0 S
现在的问题是每次解冻上述两种模式的干细胞时，细胞的状态都是无比之差，多数时候都养不起来，想请教各位战友：1、针对上述两种情况，你们实用的冷冻液的配方是什么，冷冻时需要注意什么，比如操作的细节；2：解冻的时候有没有什么注意的；3：像我上面写的干细胞培养基中，BFGF的浓度有没有要求（我是10ng/ml),谢谢指导

流泪的鱼

冷冻液的配方不对，你做过对比实验吗？选择一个最优化的配方。冷冻液提前处理了吗？消化的方法也待商榷，你对细胞太粗暴了，细胞很娇嫩！

qiushuiwuhen

回复 流泪的鱼 的帖子2 o' w; j: G+ h- X9 l% N. I

, h1 I: P7 {- m* c请教您的详细指导

qiushuiwuhen

http://www.biomart.cn/experiment/430/488/490/495/30778.htm自己顶下

sleevexz

FBS 多加一些，可达50-90%, 20%的DMSO要预先冷藏，然后与细胞悬液1:1混合

千细胞

就9成的FBS加1成的DMSO;
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heming

自己觉得一个比较好的冻存液配方，FBS 90%  DMSO5%  细胞5%  

mtdj1314

IV胶原酶（1mg/ml）在37度预热，消化20~30min，效果还可以，这是有feeder的。干细胞团块吹打到传代大小，冻存体系可以再把FBS加大一成试试~

qiushuiwuhen

感谢上面几位胞友的详细指导，那你们解冻的流程怎样呢，解冻效率高吗，有没有什么诀窍，谢谢不吝指教

细胞海洋

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