关于细胞污染

樱花草

今实验观察贴壁细胞，找不到细胞，并有少量活着的悬浮细胞，在悬浮细胞的下面出现很多轮廓不清晰的细胞，细胞已丢弃，未拍照，我想请教一个，细胞细菌检测可以用内毒素，那么真菌检测用什么方法呢，还有支原体用什么方法检测呢，可快速出结果的。急！急！急！

wf78365421

真菌是做培养检测。
  Y4 c# k3 p7 N0 `支原体有专门的试剂盒检测。

樱花草

回复 wf78365421 的帖子( }; J6 i- I1 ]6 F0 H" |5 \
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谢谢！

heming

①相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察.支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。
$ ?2 w7 v3 `- W5 u% y( P. \  @  J; v②荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗.置于用生理盐水配浓度为50pg/ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min.向细胞面滴加pH5.5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。& n4 a: X1 t& E- k2 H+ u
③电镜检查;用扫描电镜方法简便快速.也可以利用透射电镜。
9 F, I& Y. H0 f④DNA分子条文检查或支原体培养等方法：检出率高.但方法较为复杂
. V3 s: ~& B9 p: W7 p% ]网络资料   

iytbxxg

需氧菌、厌氧菌及真菌可以用血培养仪检测，这是比较好的方法，出结果同样比较快。自然平板培养加革兰氏染色也可以测出。
/ p: ?+ U0 }6 c  q6 N, M8 S内毒素检测应该与细胞无关吧，内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以说检出内毒素不一定就说明有革兰氏阴性细菌，可能革兰氏阴性细菌已经死了，更不能说明有细胞了。
$ v* G* k# M" L# Q支原体大多数用PCR，快速方便，就是假阳性高

cn8867567

支原体检测可以用PCR：1.取细胞培养液上清至EP管中。2. 将上清100℃加热10min。3.培养液12000rpm离心3min。4. 取上清3μL配成20μLPCR反应体系（引物序列F:gggagcaaacaggattagtatccct；R:tgcaccatctgtcactctgttaccctc）5.PCR循环温度：95℃ 3min；（95℃，30s；51℃，40s；72℃，30s）×35个循环，72℃，10min。6.用2%琼脂糖凝胶电泳检测，若250bp左右有条带，污染！
5 O" u+ V* k4 O+ P) P. E

三月桂花香

有血培养仪么，直接用血培养仪可以检查需厌氧真菌，内毒素测细菌，是不是不太全面呢?支原体直接PCR法，2010版药典上面可以参考，当然，无菌实验上面也有很详细的介绍。

moonison

唉，我就搞不太清楚为啥非要弄明白细胞污染的原因，甚至要搞清楚具体的细菌还是真菌还是衣原体，污染了就销毁掉重新来过，然后小心一点别污染不就可以了么。。。

淡定的摩羯

时间充足的话还是搞明白污染原因比较好
7 b3 s4 T1 i: S% v1.知道原因后可以更加注重细节，方便以后的操作  b  }% v* x0 z4 T4 Q% E6 D2 V* K
2.积累经验，万一很重要的细胞污染啦，必须要保种，弄明白原因对症下药才能有成效呀+ C7 ~* T: h# r
很喜欢这个交流平台   大家互相学习   共同努力呦！

yangweirenhao

可以先送检需厌真菌用血培养仪测，比较可靠，或者再加一个菌落平板涂布，支原体用PCR检测，或DNA荧光染色，单一的支原体检测方法不是十分可靠，可以复合使用，单纯测内毒素意义不大