转化后的大肠杆菌涂板长不起来

Damon-Salvatore

     我构建了一个PEGFP-C1的表达载体，这个质粒载体本身含有卡那霉素抗性的基因。将构建好的载体使用快转的方法转化到感受态大肠杆菌中，然后取200微升该菌液涂到含有卡那霉素抗性的固体培养基上，结果过了26个小时了，菌都没长起来，可奇怪的的是将200微升该菌液在含有卡那霉素的抗性的液体LB中转摇，大肠杆菌却可以大量繁殖。
" o& K4 X* l* |8 L     这究竟是为什么？

fguw

液体培养基可能有污染，

heming

这个你只能做最坏的考虑：可能是没有转化成功，液体的被污染了。最好重新转化一次吧

cn8867567

你把摇出来的菌，涂个板，挑克隆后，提质粒看看有没有转进去，或者做个pcr？

妖妖空

7 K9 c! T* D- X. V; P9 T, Q4 e, d& y
不知道是不是你的表述不清楚，这个取200ul是怎么做的，大肠杆菌是DH5α吗，我们的一般操作是，转化后先要摇床培养3个小时（EP管立着放），然后离心，倒掉上清，管中留下约100ul，然后吹打重新悬浮，然后全部吸取用来涂平板，不知道你的取200ul是不是这个操作。
6 X. f' L; ^* H不过我认为你可以把液体培养基中长出来的菌，取点出来涂在板子上看看长不长，要是有单菌落的话，你可以做个菌落PCR鉴定，要是没有的话，那可能就是固体培养基有问题了。因为既然液体LB中有菌生长，（排除污染的可能）说明已经转成功了。

fguw

妖妖空,  你给我一个理由固体培养基有问题？; Q; n: i4 h4 G
固体跟液体的差别在什么地方，琼脂， 而没有任何理由，液体培养基可以长的很好，而固体培养基没有长的（如果培养基都没有污染的话).      当然，这里面另外还有1点需要指出，很少有人去同时接固体和液体的，没什么意义。如果你的实验基本功没有问题，不需要这样去做。, ?% }6 B$ j- F3 |$ k; V2 }3 q: v% p

细胞海洋

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看6楼

细胞海洋

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妖妖空

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4 r( q8 c/ O7 n# j) |0 T% `! ^& o* p
我是这样想这个问题的：
. d" |) W# |) o+ p9 }9 ~# w/ R现象：转化的大肠杆菌在平板上没有菌落，而在LB液体培养基中有大量繁殖；7 z; {% l( p: W" J% {! E5 D( {2 U5 W
1、确定液体LB中的是不是目的重组子（也有确定是不是污染），涂平板（如果能在先前的板子上长出菌落来，说明液体LB中的菌本身就有问题了），看菌落形态，做个菌落PCR。所以我觉得第一步要确定液体LB中是不是有污染。
; p' Y$ H* I% g2、我说的固体培养基有问题是在上述条件成立的基础上，即LB中的大肠杆菌中有目的重组子。) }: {* G7 Q; L2 T& f
3、至于你说的同时接固体和液体培养基，我也没有说要这样做，我只是说在解决这个问题的时候可以这样做，本来挑选阳性克隆都是涂板子选单菌落的。（涂平板是稀释，方便单菌落的挑选，液体培养一般都是增殖培养，大量获取）
9 ]6 |$ @& I/ z* {. Z4、你没有发现LZ做转化用的是单个标记吗，一般都是载体和受体上采用不同的抗性或营养标记来进行筛选的，即使这样都有假阳性的。4 n" C/ v2 `  g

moonison

呵呵，第一说明你的转化效率低，质粒构建有问题，建议重新酶切连接构建质粒，实在不行用T载体，相信涨克隆的几率会高很多，一句话还是克隆的技术不够，8 L- b6 b8 _3 X- m6 j7 p4 T: ^
第二，涂在板子上没长，而放到液体培养基里面就可以也很容易解释的。我可以告诉你你把浑浊的液体培养基涂到板子上还是不会长克隆，因为这个时候液体培养基的卡那霉素根本不够杀死那么多的细菌，所以还是有一些没有转入质粒的细菌存活并生长了下来。8 T" J3 u% `& D! p& V
克隆是最基本的分子生物学的实验技巧，在你这种情况下无需考虑太多，好好看下《分子克隆》，请教下师兄师姐克隆的技巧就可以了。根本就是一个很简单的技巧问题，不要想那么没用的，以为会有什么新发现！