人羊膜上皮细胞的分离、原代及传代培养

单个核细胞

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1.人羊膜上皮细胞原代接种后，在未添加任何细胞因子的培养条件下，生长缓慢，如果添加细胞因子的话可以添加哪种因子及其适宜浓度？+ {$ j) Y% I1 ]: C

( F& t" Q5 `8 B3 ?8 Q2.在培养过程中（原代及传代），尤其是传代培养后，如何抑制间充质样细胞的优势生长？6 ^/ B  [: e/ D3 m
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贴上几张人羊膜上皮细胞照片供大家品评：- z7 _# X, E. v* j/ o* V+ Z

" y5 O: ?" M3 y（1）原代培养阶段：原代接种第6、7、8天的照片，原代分离得到的细胞还是蛮多的2 r1 m" o! t$ A: ?* l( j; z2 b

2013-9-11 14:17 上传

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（2）传代培养阶段：传代接种第第3、4、5天的照片，间充质样细胞优势生长
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2013-9-11 14:17 上传

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（3）传代培养阶段：传代接种第第6、7、8天的照片，间充质样细胞优势生长; [3 X4 e' r8 i

2013-9-11 14:17 上传

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坤明

ruofan1982

看图片，你们原代分离的羊膜上皮细胞纯度还是蛮高的，可否分享一下你们的分离方法。. ?9 C) D$ b7 l; d; l6 Z# L; e

2 C, W$ z' e6 s0 U- v' w9 w% V羊膜上皮细胞培养比较困难，生长缓慢，一般传代三代后基本就不生长了。我们平时培养添加了EGF，但是效果也不是很明显，有更好的方法吗？

单个核细胞

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  K! ^) J9 p6 h# L0 q6 ^回复 ruofan1982 的帖子. o" |% I% h3 |+ j2 P
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我现在也在摸索制备方法，这次贴的图片是用三种不同的酶组合消化后接种的，分别是胰蛋白酶、胰蛋白酶+Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶+Ⅳ型胶原酶，让我惊讶的是三种酶组合消化分离原代接种后长出来的情况差不多，我再重复试验时却达不到这个效果。现在正在改进试验方法，可以互通有无， 。

ruofan1982

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, ~  Y4 h* K2 x/ a7 h8 h" S  s0 s: f# o1 @
你是直接用混合陪消化的吗？还是分步消化？

coffee.cat105

单个核细胞 发表于 2013-9-11 15:06 * a2 C5 I/ @% R4 O1 X  p) }
回复 ruofan1982 的帖子9 P7 J, E9 ^; `. P9 A6 M& g) d. D

2 r% }4 }: Q' Q9 o; N- e% Z1 }. j我现在也在摸索制备方法，这次贴的图片是用三种不同的酶组合消化后接种的，分别 ...

+ z# p7 B0 X: `1 f/ r2 p4 N
你们用胶原酶消化下来也是这个效果吗？我们用胶原酶消化下来都是间充质，先用胶原酶后用胰酶的效果也是间充质居多，只有只用胰酶的稍稍好些，但是也没有你这个纯，请问一下你用的多少浓度的胰酶，多少浓度的胶原酶，我们用的0.025的胰酶和0.01的胶原酶的

单个核细胞

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# H* G. c! e- Z# T9 u) I+ ?
$ b' R& N& t& X; t4 e上面照片的这个是直接混合消化的，没有分步消化，后来我做的分步消化，其结果几乎都是得到间充质样细胞。我个人觉得上面照片的这份样本可能是一个偶然情况，因为后来我重复试验不可行。

wf78365421

回复 单个核细胞 的帖子) g& k2 E& D& Y/ O4 v4 f

8 q/ E/ H0 b0 k/ \是上皮细胞还是间充质细胞需要鉴定，不能光看形态。

单个核细胞

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6 k0 p7 N+ m+ Y. ^你提醒的是，，我现在只是初步分离实验，只能先通过形态观察，后面条件允许的话我会鉴定的。

一转身的距离

羊膜从结构上来讲，最外面是羊膜上皮，然后是一层无细胞的基底层，然后是含间充质细胞层，请问楼主消化前是不是已经把羊膜与绒毛膜分离了？然后消化完之后是不是已经把基底膜都消化掉了？你认为的这种间充质细胞是羊膜间充质还是绒毛膜间充质？如果单纯用胰蛋白酶消化的话，理论上是不会进入基底层里面的。个人觉得你的第一张图看上皮细胞还是比较纯的。不过没有鉴定就不好说纯度的问题。另外，也有文献报道羊膜上皮细胞在体外培养的过程中，会有EMT现象的发生，所以个人觉得你传代后出现间充质样形态细胞的来源也不好说。羊膜上皮细胞因为没有端粒酶活性，不能无限增殖，我所看见的资料培养体系中都添加了10ng/ml的EGF。