人羊膜上皮细胞的分离、原代及传代培养

单个核细胞

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, @; Z& G- C& U, r/ g8 c) ^1.人羊膜上皮细胞原代接种后，在未添加任何细胞因子的培养条件下，生长缓慢，如果添加细胞因子的话可以添加哪种因子及其适宜浓度？
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2.在培养过程中（原代及传代），尤其是传代培养后，如何抑制间充质样细胞的优势生长？; f2 M3 G0 z  B$ u; G/ P

% Q5 S/ w5 b; p1 O$ o贴上几张人羊膜上皮细胞照片供大家品评：
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（1）原代培养阶段：原代接种第6、7、8天的照片，原代分离得到的细胞还是蛮多的: ~8 Y2 w! I$ O; c& P

2013-9-11 14:17 上传

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( Q7 O2 [7 u  V; U- J* H（2）传代培养阶段：传代接种第第3、4、5天的照片，间充质样细胞优势生长
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2013-9-11 14:17 上传

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) z# q: x# E8 `  J（3）传代培养阶段：传代接种第第6、7、8天的照片，间充质样细胞优势生长+ d' P- Y0 v8 g+ p

2013-9-11 14:17 上传

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坤明

ruofan1982

看图片，你们原代分离的羊膜上皮细胞纯度还是蛮高的，可否分享一下你们的分离方法。
# J4 M0 `, c6 \* x* j6 b) k
( A# R2 J7 K- x% W/ C% s3 x" \+ Q羊膜上皮细胞培养比较困难，生长缓慢，一般传代三代后基本就不生长了。我们平时培养添加了EGF，但是效果也不是很明显，有更好的方法吗？

单个核细胞

3 `* L' J! [6 x* P4 j0 ~+ I' F8 ]7 P( w  ?
回复 ruofan1982 的帖子; A+ D2 j3 k( @
6 m! C: i$ X- i- G! I
我现在也在摸索制备方法，这次贴的图片是用三种不同的酶组合消化后接种的，分别是胰蛋白酶、胰蛋白酶+Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶+Ⅳ型胶原酶，让我惊讶的是三种酶组合消化分离原代接种后长出来的情况差不多，我再重复试验时却达不到这个效果。现在正在改进试验方法，可以互通有无， 。

ruofan1982

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+ g8 ~  L, J7 g3 _' d' t
* T) S+ [" o9 p- m你是直接用混合陪消化的吗？还是分步消化？

coffee.cat105

单个核细胞 发表于 2013-9-11 15:06 6 q6 z) \3 k% T2 q9 C2 r. m5 P
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6 R" x: ~: ~3 V( I, O
/ {% ]7 A' [0 ^+ O8 P6 ^+ B( x我现在也在摸索制备方法，这次贴的图片是用三种不同的酶组合消化后接种的，分别 ...

$ A& _- i+ n/ Z
你们用胶原酶消化下来也是这个效果吗？我们用胶原酶消化下来都是间充质，先用胶原酶后用胰酶的效果也是间充质居多，只有只用胰酶的稍稍好些，但是也没有你这个纯，请问一下你用的多少浓度的胰酶，多少浓度的胶原酶，我们用的0.025的胰酶和0.01的胶原酶的

单个核细胞

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: L9 b, C) K9 w# c0 u+ M" z) Z  P) P& B$ x' S1 j& U  J
上面照片的这个是直接混合消化的，没有分步消化，后来我做的分步消化，其结果几乎都是得到间充质样细胞。我个人觉得上面照片的这份样本可能是一个偶然情况，因为后来我重复试验不可行。

wf78365421

回复 单个核细胞 的帖子9 O1 e  H! z4 _* W9 F( j
5 g/ b1 E7 d) z4 e- }
是上皮细胞还是间充质细胞需要鉴定，不能光看形态。

单个核细胞

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6 k9 K+ X! ], _, m% D5 d( ]% j" O) ]+ O" ]2 w* V
你提醒的是，，我现在只是初步分离实验，只能先通过形态观察，后面条件允许的话我会鉴定的。

一转身的距离

羊膜从结构上来讲，最外面是羊膜上皮，然后是一层无细胞的基底层，然后是含间充质细胞层，请问楼主消化前是不是已经把羊膜与绒毛膜分离了？然后消化完之后是不是已经把基底膜都消化掉了？你认为的这种间充质细胞是羊膜间充质还是绒毛膜间充质？如果单纯用胰蛋白酶消化的话，理论上是不会进入基底层里面的。个人觉得你的第一张图看上皮细胞还是比较纯的。不过没有鉴定就不好说纯度的问题。另外，也有文献报道羊膜上皮细胞在体外培养的过程中，会有EMT现象的发生，所以个人觉得你传代后出现间充质样形态细胞的来源也不好说。羊膜上皮细胞因为没有端粒酶活性，不能无限增殖，我所看见的资料培养体系中都添加了10ng/ml的EGF。