IPS基础问题

gzeb

之前我对iPS没怎么了解，今天进入这个版块看了一些大家的讨论，很多陌生的东西。这个东西原理清楚，同仁们可以分享下你们的实验大概流程吗？（这个可能问题面有点大，不过大家随便说点，这方面我是初学者，求教）

gzeb

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" ?5 d: g# k2 G
谢谢，学到了点东西！

wanglimaomao

以下内容仅以无feeder培养ips为例
  J4 g" j' K/ W& ~一，如果你没有现成的细胞，就准备自己构建，addgen购买相关的含有这几个基因的质粒，自己构建腺病毒，或者慢病毒，包装病毒，转染你能拿到的人的或者动物的体细胞，进行体细胞重编程，获得你需要的ips，有文献报道说缺氧可以提高重编程成功率，可以试试看，" c( Z+ t: h' f8 R' S, f
二，鉴定你获得的ips克隆，进行扩增，现在有两种培养方法，一是有feeder cell,另外一种就是在matrigel上培养的无feeder的，stemcell公司有现成的培养基，所有培养基你可以参考相关文献。培养过程中就要注意防止分化的问题了，都是细节的问题，比如氧浓度控制，血清控制，冻存，每日更新培养基，及时传代等
. K; X1 g  X# p7 T4 B/ B) n" G三，一般培养过程中都会有不同程度的分化，有2种方法可以纯化，一是刮除法，去除分化细胞团，而是消化法，我个人经验，就是用accutase消化过程中，分化细胞容易先变圆，ips细胞还没有变化的时候，终止消化，轻轻去除分化的细胞，这种干细胞纯化方法相对简单很多，纯化效果也不错
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9 }2 I+ t4 t( y8 Y& V* M/ o四，诱导分化，就是根据自己的实验需要，查阅相关文献，找到适合自己的分化方式，不同的组织细胞分化方法都不一样，而且不同实验室做的也不一样，就看你喜欢那种，分化后就是鉴定了。得到你需要的，有时候需要高纯度的分化细胞，你可以用特异性抗体标志的磁珠筛选，或者流式筛选都可以。" y- H( C# e$ W. x7 f+ N
大概实验流程就是这样，无法具体到每个步骤，只能根据你自己的实验需要，和你的现有条件进行实验

gzeb

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! j5 t9 o+ D! q# V! r- u* L. q% t' i% E6 D* f- W
谢谢！这个大致了解，知道他的应用前景。过程是涉及到去分化和诱导，这里面会涉及到那些基础实验呢

wanglimaomao

这个细胞暂时看，就是可能在将来要取代胚胎干细胞的新细胞。因为它具有ESC的基本特性，但又没有伦理学争议，而且可以个体化，这是其优于ESC的最大特定。! M( T. w$ z' E4 f
首先，构建细胞。已经有多种方法，最初就是转入四个基因，OCT4，C-MYC,SOX2，KLF4或者OCT4，SOX2，LIN28,andNANOG, 后续又有多个实验室进行尝试，可以用三个因子，蛋白，小分子等进行构建，主要是为了去除其致瘤性和提高转化率。原理很简单，但想法很有创新性。3 J. X, i- I* Z1 z7 j9 I! n5 q
其次就是iPSCs的大量扩增，如何保证干性的同时能够大量扩增，以满足临床的应用# `* G; `; \( [: D
再次，也是主要问题，就是分化，定向分化的好处就是能够多方面应用ipsc,比如遗传性疾病的个体化治疗。目前在神经，视网膜等都有了较大的突破，在其他方面细胞分化研究中，进展也非常快，所以有很广阔的研究空间。) d, s% D  H* A1 y4 ?; q' T3 r/ k
最后，iPSC库的建立，当然这还是起步阶段，如果iPSC一旦通过各个国家政府的同意，或者科学界的认可，建立这样一个细胞库，人类疾病的治疗将进入一个崭新的时代。  J0 A5 W: h; u8 {' N# G1 }: u
以上均是个人对iPS的理解，如有偏颇，希望指正。谢谢前辈指导。
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