基因组编辑工具新工具：改造Cre重组酶

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基因组编辑工具新工具：改造Cre重组酶( V# h$ |0 Q. |7 t& ?! f
2013-10-22 来源：ebiotrade 作者：koo
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ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas 系统是当今十分流行的基因组编辑工具，但它们并不是唯一的选择。位点特异的重组酶也很有用。如今，哈佛大学的研究人员报告了一个重组酶的突变体（Cre），其特异性比野生型的酶要高得多，这一特点对基因治疗应用来说极具吸引力。4 y/ v7 o5 W8 y) \$ U
Nikolai Eroshenko 是哈佛大学工程和应用科学院的研究生。他和他的导师—著名的遗传学家 George Church —在《自然-通讯》上发表了他们的研究成果。5 w% J# u% s, c
Eroshenko 的研究方向是人类基因治疗，也就是用野生型或“正确”的副本来替换突变基因。但是，将这一副本插入基因组却并不容易。研究人员可以使用病毒，但无法控制整合位点。引入双链 DNA 断裂的核酸酶是另一种选择，但它们需要同源重组的修复，这在人类细胞中相当罕见。
2 a, A4 y& z' r3 a& k- a1 h$ u, FCre 等重组酶在人类细胞中非常高效，也不需要内源的 DNA 修复。为了使用它们，研究人员必须改造重组酶结合位点（ loxP ）和待插入的 DNA ，剩下的就由酶来完成。一般来说，重组酶过程被认为相当特异。然而，一些证据也表明脱靶效应的可能性。+ G4 q( M, i$ h; E' B" W0 o6 y
为了提高 Cre 的特异性， Eroshenko 利用数学建模来确定改善蛋白准确性而又不牺牲效率的策略。他发现，针对 Cre 形成二聚体能力（而不是与 DNA 结合）的突变有可能会成功。
- F( Q' |# A1 l随后 Eroshenko 利用 PCR 突变法来改造蛋白 N 端附近的 α 螺旋，它参与了二聚化，而未参与 DNA 结合。利用双选择策略，他确定了三个突变体，它们全都保留了正确靶定 loxP 位点的能力，但又避开与 loxP 相似的假序列。他在体外以及细菌和哺乳动物细胞内将这些突变体与野生型的 Cre 重组酶进行比较，发现酶的效率稍低，但更加特异。
; o$ O# x  d" z- Z# Z, x在大肠杆菌中，Eroshenko 观察到野生酶的错误率约为 1/10,000 个细胞。“我们有些突变体要高三个数量级或以上。”2 b& j/ h5 A+ }; a( U
Eroshenko 表示他的长期目标是重新改造重组酶，让它靶定 loxP 之外的位点，如人类基因组中已经存在的内源 pseudo- loxP 位点，这样重组酶就可以用于未经修饰的基因组。
/ i+ |# T1 i) Y8 d' ^不过，梅约诊所的助理教授 Karl Clark 对此结果表示很惊讶。他本人也在研究基因组编辑工具，包括重组酶 Cre。“我没有听到很多人抱怨 Cre/loxP 是非选择性的，”他说。  }+ \- V% _. [
Clark 表示，他计划在其实验室中尝试这些新的突变体，看看它们是否在斑马鱼中起作用。他指出，对于许多应用，如转基因应用，利用 Cre 来短暂激活沉默的基因，野生酶的准确性已足够。! j! E- g" D: M3 l% X/ h
延伸阅读：
  t1 B- ^2 \7 Y1 k基因组工程学里的三大利器 ——ZFN、TALEN和CRISPR/Cas( f9 U$ b! C( v
原文检索：
( I2 Z" \2 R/ O! T' lNikolai Eroshenko & George M. Church. Mutants of Cre recombinase with improved accuracy. Nature Communications, 23 September 2013; doi:10.1038/ncomms3509; _( z% J1 G" u3 R! ?! e% D8 z1 \
期刊
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461650833

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4 e* b' O9 M- Z我重新弄了一个链接 可以试试好使不！

461650833

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这是我新弄的 大家看看好使不

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怎么会？？我都下载了啊
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细胞海洋

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& h& Z/ m, Z7 ]1 D0 }# X; Y4 `  ?. H: q; w
地址不对 再发一次

279042256

谢谢

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) p6 G5 \3 O* ^客气了

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谢谢！

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' S8 |& Q( l! N0 N9 y6 A: Hhttp://pan.baidu.com/share/link?... 2&uk=1143554654呵呵 我搜到的一个下载链接 大家去下吧