基因组编辑工具新工具：改造Cre重组酶

yinfuhua

基因组编辑工具新工具：改造Cre重组酶
3 b0 r* o+ R- E, r, l) O2013-10-22 来源：ebiotrade 作者：koo 8 s& E, [2 d) g% j1 T2 F9 p
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ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas 系统是当今十分流行的基因组编辑工具，但它们并不是唯一的选择。位点特异的重组酶也很有用。如今，哈佛大学的研究人员报告了一个重组酶的突变体（Cre），其特异性比野生型的酶要高得多，这一特点对基因治疗应用来说极具吸引力。
; v8 z" M0 ?% j9 {" O  F# mNikolai Eroshenko 是哈佛大学工程和应用科学院的研究生。他和他的导师—著名的遗传学家 George Church —在《自然-通讯》上发表了他们的研究成果。
  y+ D+ Y+ y9 O& F& {! M! ~Eroshenko 的研究方向是人类基因治疗，也就是用野生型或“正确”的副本来替换突变基因。但是，将这一副本插入基因组却并不容易。研究人员可以使用病毒，但无法控制整合位点。引入双链 DNA 断裂的核酸酶是另一种选择，但它们需要同源重组的修复，这在人类细胞中相当罕见。$ s, E) |/ Y6 Y# t& h. R
Cre 等重组酶在人类细胞中非常高效，也不需要内源的 DNA 修复。为了使用它们，研究人员必须改造重组酶结合位点（ loxP ）和待插入的 DNA ，剩下的就由酶来完成。一般来说，重组酶过程被认为相当特异。然而，一些证据也表明脱靶效应的可能性。: E8 J6 G, O' L: g# L% D/ r: y4 K: Z
为了提高 Cre 的特异性， Eroshenko 利用数学建模来确定改善蛋白准确性而又不牺牲效率的策略。他发现，针对 Cre 形成二聚体能力（而不是与 DNA 结合）的突变有可能会成功。
& h: ]; I4 ]7 L, X随后 Eroshenko 利用 PCR 突变法来改造蛋白 N 端附近的 α 螺旋，它参与了二聚化，而未参与 DNA 结合。利用双选择策略，他确定了三个突变体，它们全都保留了正确靶定 loxP 位点的能力，但又避开与 loxP 相似的假序列。他在体外以及细菌和哺乳动物细胞内将这些突变体与野生型的 Cre 重组酶进行比较，发现酶的效率稍低，但更加特异。
4 y& ^; e+ ?3 n' S) {, f  f在大肠杆菌中，Eroshenko 观察到野生酶的错误率约为 1/10,000 个细胞。“我们有些突变体要高三个数量级或以上。”
2 X9 B+ X6 W) Q9 i. REroshenko 表示他的长期目标是重新改造重组酶，让它靶定 loxP 之外的位点，如人类基因组中已经存在的内源 pseudo- loxP 位点，这样重组酶就可以用于未经修饰的基因组。: k3 c( r+ C  T- Q9 Z1 ^0 {9 T
不过，梅约诊所的助理教授 Karl Clark 对此结果表示很惊讶。他本人也在研究基因组编辑工具，包括重组酶 Cre。“我没有听到很多人抱怨 Cre/loxP 是非选择性的，”他说。
' p# m, A& w0 o* b9 L; @Clark 表示，他计划在其实验室中尝试这些新的突变体，看看它们是否在斑马鱼中起作用。他指出，对于许多应用，如转基因应用，利用 Cre 来短暂激活沉默的基因，野生酶的准确性已足够。" [( j' e6 O) n0 p8 p- [) ]6 m
延伸阅读：4 z5 h- j$ k2 {5 u8 |# r$ h
基因组工程学里的三大利器 ——ZFN、TALEN和CRISPR/Cas
. q! Q2 [+ V* H0 g7 w4 b原文检索：- K) B5 x( Y( A! c7 x2 {1 u
Nikolai Eroshenko & George M. Church. Mutants of Cre recombinase with improved accuracy. Nature Communications, 23 September 2013; doi:10.1038/ncomms35097 g1 X; B* M9 n) h) Y
期刊' b5 y& Z' L* `5 U/ m

461650833

' E3 E# A' ~6 {/ n: U' w/ D- b0 R0 E" D' w2 C7 h6 Y  ?, ]7 k
http://pan.baidu.com/share/link?... 2&uk=1143554654呵呵 我搜到的一个下载链接 大家去下吧

yinfuhua

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谢谢！

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客气了

279042256

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细胞海洋

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5 S; S! u7 i7 B: r5 E' ~. G/ ?
地址不对 再发一次

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$ u+ m( I( Y2 @7 W怎么会？？我都下载了啊5 B" Q/ `2 o3 [! U' h

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http://pan.baidu.com/s/1suWx85 K- F' I3 G" X
这是我新弄的 大家看看好使不

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9 q2 q/ |8 w! r" A( ?
我重新弄了一个链接 可以试试好使不！