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基因组编辑工具新工具：改造Cre重组酶6 Y) y' e2 T3 K6 Q' Y! N* r1 p
2013-10-22 来源：ebiotrade 作者：koo
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0 C: v0 x8 Z8 }8 B; iZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas 系统是当今十分流行的基因组编辑工具，但它们并不是唯一的选择。位点特异的重组酶也很有用。如今，哈佛大学的研究人员报告了一个重组酶的突变体（Cre），其特异性比野生型的酶要高得多，这一特点对基因治疗应用来说极具吸引力。9 `: K7 L* y( G6 C
Nikolai Eroshenko 是哈佛大学工程和应用科学院的研究生。他和他的导师—著名的遗传学家 George Church —在《自然-通讯》上发表了他们的研究成果。8 y# p) P' X3 a6 _( A7 W! j
Eroshenko 的研究方向是人类基因治疗，也就是用野生型或“正确”的副本来替换突变基因。但是，将这一副本插入基因组却并不容易。研究人员可以使用病毒，但无法控制整合位点。引入双链 DNA 断裂的核酸酶是另一种选择，但它们需要同源重组的修复，这在人类细胞中相当罕见。
+ G0 q) Y t% S5 ~Cre 等重组酶在人类细胞中非常高效，也不需要内源的 DNA 修复。为了使用它们，研究人员必须改造重组酶结合位点（ loxP ）和待插入的 DNA ，剩下的就由酶来完成。一般来说，重组酶过程被认为相当特异。然而，一些证据也表明脱靶效应的可能性。1 }' {8 V! @; E9 `% D
为了提高 Cre 的特异性， Eroshenko 利用数学建模来确定改善蛋白准确性而又不牺牲效率的策略。他发现，针对 Cre 形成二聚体能力（而不是与 DNA 结合）的突变有可能会成功。
/ C* }- _# d0 C随后 Eroshenko 利用 PCR 突变法来改造蛋白 N 端附近的 α 螺旋，它参与了二聚化，而未参与 DNA 结合。利用双选择策略，他确定了三个突变体，它们全都保留了正确靶定 loxP 位点的能力，但又避开与 loxP 相似的假序列。他在体外以及细菌和哺乳动物细胞内将这些突变体与野生型的 Cre 重组酶进行比较，发现酶的效率稍低，但更加特异。
/ n# h& I6 Q" J在大肠杆菌中，Eroshenko 观察到野生酶的错误率约为 1/10,000 个细胞。“我们有些突变体要高三个数量级或以上。”
2 X. o! o- F' n& g, vEroshenko 表示他的长期目标是重新改造重组酶，让它靶定 loxP 之外的位点，如人类基因组中已经存在的内源 pseudo- loxP 位点，这样重组酶就可以用于未经修饰的基因组。) p, \- ~ y/ \9 T
不过，梅约诊所的助理教授 Karl Clark 对此结果表示很惊讶。他本人也在研究基因组编辑工具，包括重组酶 Cre。“我没有听到很多人抱怨 Cre/loxP 是非选择性的，”他说。" |/ `4 ] W& }5 v
Clark 表示，他计划在其实验室中尝试这些新的突变体，看看它们是否在斑马鱼中起作用。他指出，对于许多应用，如转基因应用，利用 Cre 来短暂激活沉默的基因，野生酶的准确性已足够。
2 d/ F- |8 k/ x- m! h延伸阅读：
8 d4 `; E& Q* J [. ?) W" w0 _6 U基因组工程学里的三大利器 ——ZFN、TALEN和CRISPR/Cas
' j3 S% B+ D; P( Y. _% T3 Y- y原文检索：
* v2 w" L0 ~, K5 [4 l' p1 O* c4 E' D+ [Nikolai Eroshenko & George M. Church. Mutants of Cre recombinase with improved accuracy. Nature Communications, 23 September 2013; doi:10.1038/ncomms3509
9 Q0 J% e0 }7 c% h5 J& T+ D: h0 k期刊5 E& D4 @" G, d( V. E2 Z9 O
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发表于 2013-10-23 00:14
发表于 2013-10-23 14:35
' e% L9 U" n: Z1 j, I5 P0 b
发表于 2013-10-24 08:03
