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基因组编辑工具新工具：改造Cre重组酶 v7 y W! `8 D3 m0 `) K9 k
2013-10-22 来源：ebiotrade 作者：koo
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ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas 系统是当今十分流行的基因组编辑工具，但它们并不是唯一的选择。位点特异的重组酶也很有用。如今，哈佛大学的研究人员报告了一个重组酶的突变体（Cre），其特异性比野生型的酶要高得多，这一特点对基因治疗应用来说极具吸引力。! D6 A. ?9 F+ L; m6 }# _
Nikolai Eroshenko 是哈佛大学工程和应用科学院的研究生。他和他的导师—著名的遗传学家 George Church —在《自然-通讯》上发表了他们的研究成果。- K& L, O* R- x/ ]
Eroshenko 的研究方向是人类基因治疗，也就是用野生型或“正确”的副本来替换突变基因。但是，将这一副本插入基因组却并不容易。研究人员可以使用病毒，但无法控制整合位点。引入双链 DNA 断裂的核酸酶是另一种选择，但它们需要同源重组的修复，这在人类细胞中相当罕见。- M! P* I/ T5 M% A
Cre 等重组酶在人类细胞中非常高效，也不需要内源的 DNA 修复。为了使用它们，研究人员必须改造重组酶结合位点（ loxP ）和待插入的 DNA ，剩下的就由酶来完成。一般来说，重组酶过程被认为相当特异。然而，一些证据也表明脱靶效应的可能性。5 Z6 Z4 ~7 P* ~
为了提高 Cre 的特异性， Eroshenko 利用数学建模来确定改善蛋白准确性而又不牺牲效率的策略。他发现，针对 Cre 形成二聚体能力（而不是与 DNA 结合）的突变有可能会成功。
4 b' ~/ k p2 |% \0 i$ H: j随后 Eroshenko 利用 PCR 突变法来改造蛋白 N 端附近的 α 螺旋，它参与了二聚化，而未参与 DNA 结合。利用双选择策略，他确定了三个突变体，它们全都保留了正确靶定 loxP 位点的能力，但又避开与 loxP 相似的假序列。他在体外以及细菌和哺乳动物细胞内将这些突变体与野生型的 Cre 重组酶进行比较，发现酶的效率稍低，但更加特异。
; I' F( F5 W1 t- f* z' t在大肠杆菌中，Eroshenko 观察到野生酶的错误率约为 1/10,000 个细胞。“我们有些突变体要高三个数量级或以上。”# J* \4 Z4 n# M% J
Eroshenko 表示他的长期目标是重新改造重组酶，让它靶定 loxP 之外的位点，如人类基因组中已经存在的内源 pseudo- loxP 位点，这样重组酶就可以用于未经修饰的基因组。2 L* Y; r; R4 Q( o, l( q! D# w
不过，梅约诊所的助理教授 Karl Clark 对此结果表示很惊讶。他本人也在研究基因组编辑工具，包括重组酶 Cre。“我没有听到很多人抱怨 Cre/loxP 是非选择性的，”他说。
9 p0 X. ~1 U a" |, FClark 表示，他计划在其实验室中尝试这些新的突变体，看看它们是否在斑马鱼中起作用。他指出，对于许多应用，如转基因应用，利用 Cre 来短暂激活沉默的基因，野生酶的准确性已足够。6 G0 m$ @; z% h! Z
延伸阅读：' [* k9 Z8 `! k! a" [7 d
基因组工程学里的三大利器 ——ZFN、TALEN和CRISPR/Cas6 B8 K0 \& S6 y, k; g
原文检索：6 a$ W, m& `4 |1 h6 y4 `9 k, C# d/ J
Nikolai Eroshenko & George M. Church. Mutants of Cre recombinase with improved accuracy. Nature Communications, 23 September 2013; doi:10.1038/ncomms35093 j" P; D* }+ ~& O
期刊/ x- U/ m+ E2 b- e: [) e+ B
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发表于 2013-10-23 00:14
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