为什么提取的蛋白放到—80后再次拿出来做Western时发现管底有好多沉淀呢？

微笑流滢

1. 为什么提取的蛋白放到—80后再次拿出来做Western时发现管底有好多沉淀呢？这是为什么？2.大家放在-80的蛋白再次拿出来做Western上样之前，究竟用不用再煮几分钟呢？
0 }  c1 ^6 `5 y1 ]3.怎么保证跑出来的条带都一样宽呢？如果两个相邻的蛋白样品的上样量相差太大的话，那个上样多的会挤那个上样少的样品，所以跑出来的条带肯定一个宽，一个细，我曾用过补齐过。总觉得补齐的时候会充到下面已经加好的样品，如果提前与1X的SDS混好的话也总觉得不太准。大家有什么好的办法吗？

yuri.2004

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# `2 X' D" J- C' K0 l0 t) g6 y0 z0 |- n$ k$ O7 R( b3 G% ?
我们在做CRM197蛋白的时候也碰到过类似问题。-80℃保存，哪怕用快速融解，也会有很多絮状沉淀。这种应该属于蛋白质不可逆变性了，可能也有降解。跑电泳的话杂带应该会很多。。Western的电泳，样品应煮过，这是流程，和沉淀的关系不大~  另一个我没碰到过，虚心求教~~

微笑流滢

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那你每次上样时每个孔的上样量都一样吗？如果一个孔上5ul，邻近孔上15ul 的话肯定会挤那个加样少的吧？

yuri.2004

回复 微笑流滢 的帖子8 |+ l( {" W' D8 W* @
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不知Marker的算不算呢？我通常在Marker旁边的孔上30-40ul，Marker才3ul。。。Marker的小分子条带宽度会略微缩短，不过差异不算大。样品的话，盐浓度会影响到其他孔的条带。