求教 酶消法做脐带间充质干细胞

pcljsw2008

我之前一直都用组织块法，现在想换种方法，改酶消法。我用一倍浓度的胶原酶，体积一比一酶消剪碎的脐带组织块，离心得细胞接种，要换四次液，大概十二天，才能看到细胞增殖，接种第一天就有细胞贴壁，但会逐渐皱缩死亡，剩下一点点才能分裂，求高人指导下有没有什么更好的方法，或者我这个实验过程中有什么需要注意和改进的地方，在此谢过！！

zhangshich

如果单纯用胶原酶消化后，过滤后上清由于太多透明质酸，呈果冻状，难以离心，我们加点儿透明质酸酶消化1~2分钟，让后离心洗涤。

xuyang0317

我们使用的是胶原酶+胰酶消化，重点是胰酶消化要加血清终止，不然细胞不仅不贴壁而且还是死亡，培养细胞时要加生长因子！

sewing

我们是用透明质酸酶和胰酶一起消化剪碎后的脐带组织块，大概消化半个钟，然后用400目筛网过滤，一边过滤一边在筛网上用玻璃棒研磨组织块，这样获取的细胞量多一些，然后加入血清终止消化，离心两次，尽量去除消化酶。

luoermei11

我们采用二型胶原酶消化4个小时，消化后用100倍体积的PBS稀释，然后再用200目的筛网过滤，能消化下大量的间充质干细胞。

pcljsw2008

回复 sewing 的帖子; [& b) V0 B- R* E% W
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能告诉我下透明质酸酶，胰酶，和脐带组织的比例吗，就是两个酶的浓度，然后三者的体积比，谢谢啦，做了四批了，效果不怎么理想

pcljsw2008

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; o+ _, v6 p% M0 x- N. C& D能告诉我下胶原酶，胰酶的浓度和比例吗，以及和组织块的体积比，生长因子我加了的，我现在差不多十厘米做下来就只能接一个t25瓶子，选择性培养基培养十天左右才开始分裂增殖，而且有不少还会凋亡。谢谢啦

pcljsw2008

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对的，我现在就是这样，弄盐水稀释，再过滤的，2000转离心，但细胞还是很少，我想问下我大概十毫升碎组织，消化结束后的透明质酸需要多少透明质酸酶，浓度和体积，谢谢

sewing

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透明质酸酶和胰酶1:1的比例，消化酶能够覆盖脐带组织块就行了，如果稍微再加多一点也没关系。认识一个人，他是透明质酸酶，胰酶和胶原酶一起用，都是1:1:1的比例，效果也不错，各种酶浓度都是常规用的浓度，你可以根据消化的情况调整一下消化酶的比例和消化的时间，我个人认为酶的浓度高低影响不大。

sewing

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- ]5 k$ S" o. e/ u消化酶的浓度大了，对细胞的损伤也大。我觉得采用常规浓度，延长消化时间，对细胞损伤比较小，这是我养了几年细胞的体会，大家怎么看待这个问题呢？