南大黄行许解决CRISPR的脱靶问题（附原文）

yinfuhua

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# P0 w6 k! t  s+ S" P南大黄行许解决CRISPR的脱靶问题& H! _+ k5 z  l. S' ^  i2 ^
2014-03-06 1 来源：南京大学模式动物研究所 作者：潘德京/ t. ?$ M# ?; d) x, H( p
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南京大学模式动物研究所黄行许课题组和英国Sanger研究所 Bill Skarnes 课题组开展国际合作，利用Cas9切口酶和成对sgRNA，能够高效突变小鼠基因，并且大大降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效应，《自然-方法》(Nature Methods)于3月2日在线发表了这一研究成果。$ ]- i$ O( r: k1 d. O
以《应用CRISPR-Cas9切口酶进行最小脱靶剂量的基因组改造》（Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects）为题的论文第一作者为南京大学沈彬、Sanger研究所张文胜博士和南京大学张军，Sanger研究所Bill Skarnes教授和南京大学黄行许教授是该论文的通讯作者。这是黄行许课题组继上个月在《Cell》上发表文章后再次在高影响力杂志上发表他们的研究成果。9 P0 w8 N- p' Z0 e0 A4 _
CRISPR/Cas9系统虽然能够高效突变基因，但其脱靶效应妨碍进一步应用，特别是临床应用。为降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效应，研究小组通过改进CRISPR/Cas9系统，利用Cas9切口酶和成对sgRNA（图1），通过注射小鼠受精卵，在不降低基因突变效率的前提下，可有效降低CRISPR/Cas9系统的在小鼠基因组上的脱靶效应。成对sgRNA的选择比较关键，两条sgRNA结合不同的DNA链，其PAM序列要以尾对尾（tail to tail）出现，并且两个sgRNA结合的位点不能相隔太远，Cas9切口酶会在每个sgRNA结合的地方造成小小的单链切口（SSB），两个相邻的单链切口会形成一个DNA双链断裂（DSB），DSB的形成会激起细胞以非同源末端链接（NHEJ）的方式进行修复，该过程中会引入插入、缺失或者突变（图1）。而在潜在脱靶区域，单个sgRNA造成的SSB会通过碱基切除修复方式精确修复该区域，不会引入突变。该合作课题组通过该技术同时敲除三个小鼠基因（包括Rag1和Rag2），同时提供了免费的在线资源序列查询网站。研究结果说明这一方法可以应用于其他物种的基因组改造，并显示出临床基因治疗的应用前景。9 I) X1 d. P( _: k- z
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图1： Cas9/Paired sgRNAs strategy% }# X. N" K. e
该课题研究得到了国家基础重大科学研究计划项目（2010CB945101和2011CB944301）和英国 Wellcome Trust 核心基金的资助；沈彬得到南京大学优秀博士研究生创新能力提升计划资助。
5 a0 |1 I# T$ y8 D" `( x延伸阅读：
3 R; i3 f1 V9 O, ^9 l  |Cell：里程碑成果！中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴7 N* p$ |. X7 w5 d
原文检索：5 A6 f, e  [' Q7 _
Bin Shen, Wensheng Zhang, Jun Zhang, Jiankui Zhou, Jianying Wang, Li Chen, Lu Wang, Alex Hodgkins, Vivek Iyer, Xingxu Huang& William C Skarnes. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods, 02 March 2014; doi:10.1038/nmeth.2857
5 P: ?, P5 ^% R, r8 _5 j3 P, Y# f) c3 p1 J9 m

& K0 A3 A) E( x( l3 ]8 c3 r+ {: ^' z2 D2楼原文 感谢songzxj 提供

sicy

求原文，非常感谢！

songzxj

yinfuhua

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4 C0 t, c% O. h8 y谢谢提供原文。

fengqingrusi

很不错的设计思路。