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你这个现象显然不正常。9 v+ E" K+ B e" i
分享一下我们实验室采用的protocol:" k! J/ H2 h- K
通过EB途径将hESC定向分化为心肌细胞。
H: {8 v) g9 p5 W) o; S1. 心肌分化前细胞培养的准备% p/ [' S- |& n0 o6 y7 p3 Y
（1）在开始分化前，hESC至少在标准密度（0.75×10^5个细胞/ml）的MEF上传代3次。
3 h; K+ ?+ t5 ]/ ]. h（2）在EB形成前1代，hES细胞需传至低密度(0.5×10^5个细胞/ml) MEF上培养3-5天。
" q6 Z2 Q( Y8 p) U# h0 n. y7 @2. 心肌分化第0天
- _7 x4 w* f) P5 I0 y# \ G, m. v（1）待分化的hES细胞培养3-5天后，用分散酶/胶原酶Ⅳ消化。
; ?2 [1 C- D% I2 X（2）将培养板置37℃，5%CO2培养箱孵育20-30min，直到轻摇培养板所有细胞克隆从培养板上脱落，漂起。
( ^! ~6 P7 X" t1 y$ W, x（3）用1000 μl大tip将细胞克隆轻轻吹下，尽量保持克隆的完整性，将漂起的克隆吸入15ml离心管。
$ ^( `+ }# d, Z( }$ I% H: j' S4 u8 @（4）毎孔加1ml EB20培基冲洗培养孔，并将其吸入15ml离心管。# T+ r- `% Y# M1 f; V. o k
3. 心肌分化第1-3天: b5 `0 W4 A( U
（1）第一天，将培养板内EB吸至15ml离心管，自然沉降2-3min后，小心的吸弃上清，再加6ml EB20培基重悬细胞。2 z. i3 E9 k( a% t2 Q; o0 M
（2）在低吸附6孔板的每个孔加4ml EB20培基，然后毎孔加入（1）中的细胞悬液1ml,最终培养体积为5ml。
+ l8 H1 r8 k# A) H( N（3）继续悬浮培养EB 2天，无需换液。
+ S' L3 L- E( e& i( }. j（4）在第3天，准备0.1%的明胶包被培养板，室温包被过夜。% J. [1 N: e& J7 a% W/ o
（5）将细胞克隆在重力作用下自然沉降2-3min。& J+ a! p; B# o4 Q/ q
（6）轻轻的吸弃培基，用5ml EB20分化培基洗涤细胞克隆，至少洗涤3次，每次都让细胞克隆自然沉降。
( `4 z7 `( {& o+ C# V/ D) b（7）毎块6孔板的细胞克隆加6ml EB20培基重悬细胞。0 t1 x" ]3 Q: H5 L7 @( {
（8）在低吸附6孔板的每个孔加2ml EB20培基，然后毎孔加入（7）中的细胞悬液1ml。
5 ~, r. a8 u5 m% a/ c7 ?! B4. 心肌分化第4天
* l: |, r* u+ A# v（1）将EB从低贴附培养板吸至50ml离心管。
$ z5 d) H- X8 y9 k: u（2）将6孔板的明胶弃尽，毎孔加入EB悬液1.5ml。 ]6 F6 N- b- }' z, P
（3）毎孔再加入1.5ml新鲜的EB20培基，轻摇培养板，使EB均匀分布于培养孔) f9 { `/ L6 f& `. k
5.心肌分化第5天
4 g( u; z+ j) S3 ^ 每个培养孔加入1ml EB20培基。
0 ?+ V5 b+ K( W3 _& a: K/ o6.心肌分化第6天
, q9 Q6 U* t( U2 G3 s1 q. ] 吸弃原培基，毎孔更换3ml新鲜的EB20培基。每天都更换培基至分化第10天。& a1 ^; P/ K7 U Q
7. 维持培养% i, u0 h) Q( S3 U+ u& r6 N1 G! \2 D6 p. e
EB20培养基用于EB形成的前10天培养，然后用EB2培养基维持EB的培养；前20天每天更换培养基，20天后根据EB的密度适当减少更换培养基的频率。在心肌分化的第11-15天，陆续可以观察到类似心肌跳动的细胞克隆，且数量逐渐增加。
5 ^) K: m/ Q: p$ S) O- B* ?) b( q0 W/ l7 g
培养基配方：
6 a: `2 r, Z; V, L9 E1. EB20分化培养基
( z! g: O$ V: ?1 ]( iDMEM/F12 392.5ml, p, ?% {5 y$ D
FBS 100ml
0 T1 N& m5 Y1 p9 l% L* @200mM L-谷氨酰胺 2.5ml
, R+ O. b1 ?. e6 g6 Gβ-巯基乙醇 3.5μl- j- X) F/ a6 R d5 z& ?+ D
非必须氨基酸 5ml5 l; z$ S2 q% W, m+ R1 k. z+ }0 x
3 B7 o6 t& G) {2 w2 P, f
2. EB2培养基（500ml）+ W2 q" E8 G L* O2 O# I) R$ l- m0 P) o
DMEM/F12 482.5ml
2 J. Y2 _6 ], i0 A6 w/ mFBS 10ml [5 k* ^& H. X# {6 o
200mM L-谷氨酰胺 2.5ml
7 e" u' a5 o: g8 Nβ-巯基乙醇 3.5μl
; D7 Q( j2 X% B/ B' l非必须氨基酸 5ml
! @7 A/ l- T! n; @- s. j* A |
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发表于 2014-3-28 17:47
发表于 2014-4-1 07:38
