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你这个现象显然不正常。% v- j V5 x8 k! }: V7 q$ `2 J
分享一下我们实验室采用的protocol:. [# |/ s0 f4 Q8 p
通过EB途径将hESC定向分化为心肌细胞。
# i( N( o2 C7 [% ^# P; w1. 心肌分化前细胞培养的准备
$ ?$ Y8 {3 [! x) n+ E（1）在开始分化前，hESC至少在标准密度（0.75×10^5个细胞/ml）的MEF上传代3次。
8 {2 ?/ \+ }8 W# F. M, F$ f（2）在EB形成前1代，hES细胞需传至低密度(0.5×10^5个细胞/ml) MEF上培养3-5天。* g5 _+ ^ ^8 Q% V
2. 心肌分化第0天8 g6 k- Q1 D0 |$ U9 a8 r9 f1 E6 Z
（1）待分化的hES细胞培养3-5天后，用分散酶/胶原酶Ⅳ消化。6 g$ }" b- P& B- i K% W0 I
（2）将培养板置37℃，5%CO2培养箱孵育20-30min，直到轻摇培养板所有细胞克隆从培养板上脱落，漂起。
! l+ h. i0 U2 A& }, `（3）用1000 μl大tip将细胞克隆轻轻吹下，尽量保持克隆的完整性，将漂起的克隆吸入15ml离心管。( `, ]" @5 d- m
（4）毎孔加1ml EB20培基冲洗培养孔，并将其吸入15ml离心管。
/ a9 l; G& S: l+ P$ ^, M7 r3. 心肌分化第1-3天
' x5 s4 y2 F0 k: b（1）第一天，将培养板内EB吸至15ml离心管，自然沉降2-3min后，小心的吸弃上清，再加6ml EB20培基重悬细胞。* D9 g0 k) @, x
（2）在低吸附6孔板的每个孔加4ml EB20培基，然后毎孔加入（1）中的细胞悬液1ml,最终培养体积为5ml。
0 N0 X0 k# @# W: [% R8 {; H（3）继续悬浮培养EB 2天，无需换液。/ @) N8 `$ a) x/ j! y! C
（4）在第3天，准备0.1%的明胶包被培养板，室温包被过夜。' P4 J6 Y% C, ]5 j
（5）将细胞克隆在重力作用下自然沉降2-3min。
& H5 H% Z; W5 D& i, e+ f（6）轻轻的吸弃培基，用5ml EB20分化培基洗涤细胞克隆，至少洗涤3次，每次都让细胞克隆自然沉降。
/ M( \: p7 ^0 m5 j( O6 j h! h（7）毎块6孔板的细胞克隆加6ml EB20培基重悬细胞。: q. k) U( J8 ?+ P
（8）在低吸附6孔板的每个孔加2ml EB20培基，然后毎孔加入（7）中的细胞悬液1ml。
H% R. _. O, N8 {8 |4. 心肌分化第4天: d V" @" H4 t, a. I
（1）将EB从低贴附培养板吸至50ml离心管。7 u% d6 Q9 y& I3 Q/ Y7 t1 w
（2）将6孔板的明胶弃尽，毎孔加入EB悬液1.5ml。% u3 J8 ~. i- k& w* e2 |
（3）毎孔再加入1.5ml新鲜的EB20培基，轻摇培养板，使EB均匀分布于培养孔
4 p0 ]6 X }, m# E4 P5.心肌分化第5天# `1 y* L8 V( {, C+ t) S
每个培养孔加入1ml EB20培基。
: N, Y) V* |, }& Z+ e6.心肌分化第6天" V; N; i, c, d5 q# ^4 q4 u9 j
吸弃原培基，毎孔更换3ml新鲜的EB20培基。每天都更换培基至分化第10天。
% h+ |7 W7 g- ?5 A6 o7. 维持培养
: Q. K5 ~7 w2 I4 e. j1 f EB20培养基用于EB形成的前10天培养，然后用EB2培养基维持EB的培养；前20天每天更换培养基，20天后根据EB的密度适当减少更换培养基的频率。在心肌分化的第11-15天，陆续可以观察到类似心肌跳动的细胞克隆，且数量逐渐增加。+ _5 D9 {" s R0 e) N& {" r
* b9 ?4 }" |( C4 t' @
培养基配方：. n* R7 L( M; p! L# b9 E
1. EB20分化培养基4 J4 {" u8 g( N$ l& Y+ z. ]
DMEM/F12 392.5ml
. `4 T; v) `+ l( h- GFBS 100ml
" n) G" c* x3 p0 j200mM L-谷氨酰胺 2.5ml. b }: }; g( |7 k1 V; B* L U0 Z
β-巯基乙醇 3.5μl( L1 m3 G6 ~ k. _" w, e
非必须氨基酸 5ml! S2 ^+ C) f% e6 J
! F) F( S" a: ?+ A7 K4 a) W% H2. EB2培养基（500ml）
2 N! c' ]% g- m" t& f' \DMEM/F12 482.5ml, r9 S0 X8 ^4 [; D4 @- z! m
FBS 10ml
" @4 t5 y4 e D! z200mM L-谷氨酰胺 2.5ml+ ^3 W3 |$ [& n' q
β-巯基乙醇 3.5μl
( B* I: {2 \/ K" V( r非必须氨基酸 5ml8 x- i: Q+ J4 b$ }; L" z% n
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发表于 2014-3-28 17:47
发表于 2014-4-1 07:38
