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你这个现象显然不正常。, E( P" J$ r; ^, M! \: x! [
分享一下我们实验室采用的protocol:" [( S6 k. K# B5 m& A2 z. {. k
通过EB途径将hESC定向分化为心肌细胞。5 F% g' n( v0 f% y9 K
1. 心肌分化前细胞培养的准备% F3 \- q1 J! n* {1 w P
（1）在开始分化前，hESC至少在标准密度（0.75×10^5个细胞/ml）的MEF上传代3次。% b- \. a6 P# t# E; q1 `- Y
（2）在EB形成前1代，hES细胞需传至低密度(0.5×10^5个细胞/ml) MEF上培养3-5天。
' h% V3 h; ?# P H5 N. }, {2. 心肌分化第0天- r. g' s- R; N3 h! `3 J
（1）待分化的hES细胞培养3-5天后，用分散酶/胶原酶Ⅳ消化。
) J1 `1 M" x6 a( t1 c$ n2 o（2）将培养板置37℃，5%CO2培养箱孵育20-30min，直到轻摇培养板所有细胞克隆从培养板上脱落，漂起。6 J7 t# D1 E7 D; Z) }2 r
（3）用1000 μl大tip将细胞克隆轻轻吹下，尽量保持克隆的完整性，将漂起的克隆吸入15ml离心管。! W, S* h# H3 k" @4 k
（4）毎孔加1ml EB20培基冲洗培养孔，并将其吸入15ml离心管。& Z) B! R$ X/ F( J0 J8 d" Z; S
3. 心肌分化第1-3天
; R6 U: E/ X0 B1 R; ?: W（1）第一天，将培养板内EB吸至15ml离心管，自然沉降2-3min后，小心的吸弃上清，再加6ml EB20培基重悬细胞。1 {9 x8 Z7 v* \" x9 I$ j! \( }$ t
（2）在低吸附6孔板的每个孔加4ml EB20培基，然后毎孔加入（1）中的细胞悬液1ml,最终培养体积为5ml。# D1 b" h) s3 U
（3）继续悬浮培养EB 2天，无需换液。2 f: Q+ f0 ?0 e8 ], Q! a
（4）在第3天，准备0.1%的明胶包被培养板，室温包被过夜。
! E2 s8 N6 ~$ W2 a1 J（5）将细胞克隆在重力作用下自然沉降2-3min。
% v2 E; i/ Z6 I- _（6）轻轻的吸弃培基，用5ml EB20分化培基洗涤细胞克隆，至少洗涤3次，每次都让细胞克隆自然沉降。
# j; }! b* @* R（7）毎块6孔板的细胞克隆加6ml EB20培基重悬细胞。5 Y9 v: R+ ^- y: D
（8）在低吸附6孔板的每个孔加2ml EB20培基，然后毎孔加入（7）中的细胞悬液1ml。; X. ^3 y7 P% J4 g. w" g
4. 心肌分化第4天 g, w2 S) f( Q- W( v; n
（1）将EB从低贴附培养板吸至50ml离心管。
. m6 f0 n+ N6 B% v$ i( y9 ^9 n. h, x（2）将6孔板的明胶弃尽，毎孔加入EB悬液1.5ml。 Y2 o( |" W, [2 K8 l" D6 h9 p% D3 N
（3）毎孔再加入1.5ml新鲜的EB20培基，轻摇培养板，使EB均匀分布于培养孔7 y* y5 t* ]0 E, ~: ^
5.心肌分化第5天
5 U! b1 g& W' h, O! W' F 每个培养孔加入1ml EB20培基。
7 l" q8 h$ ], Y! K+ ]* M9 r2 A6.心肌分化第6天
+ R8 e+ l1 h, [0 M9 v8 L7 h8 W+ o 吸弃原培基，毎孔更换3ml新鲜的EB20培基。每天都更换培基至分化第10天。( S' L8 O$ X5 v9 g" I, z: A3 M
7. 维持培养
, u T- \( f& @& @6 s# H EB20培养基用于EB形成的前10天培养，然后用EB2培养基维持EB的培养；前20天每天更换培养基，20天后根据EB的密度适当减少更换培养基的频率。在心肌分化的第11-15天，陆续可以观察到类似心肌跳动的细胞克隆，且数量逐渐增加。
$ q7 o1 E% ]& s5 E h/ k/ s
7 X/ _; U+ f( w" ]( L6 }( R! m培养基配方：
5 H& ~" n( H, |* U, d# ~1. EB20分化培养基0 `( f5 ^2 Z/ M" Q
DMEM/F12 392.5ml
. R( j. d, ?! N$ p4 W/ EFBS 100ml
! C, |: W" J- D1 U3 a, H( s200mM L-谷氨酰胺 2.5ml
# ~4 Q" i0 L2 G3 C3 L _; Nβ-巯基乙醇 3.5μl
& ]/ Z$ X: R& s非必须氨基酸 5ml
$ d' m |) w% V& Y6 G3 A6 D, s
9 M+ u {1 Y) d& w2. EB2培养基（500ml）
$ k# o" m/ S# Q0 x' k: fDMEM/F12 482.5ml
# x7 L1 ?4 c& L5 V4 m2 [0 dFBS 10ml* }3 U$ l$ a9 ?
200mM L-谷氨酰胺 2.5ml. w* c6 U5 s/ B9 S$ s
β-巯基乙醇 3.5μl5 n( H1 D6 W6 Y& y
非必须氨基酸 5ml
" i. Q. K( ~7 T# `4 z |
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发表于 2014-4-2 13:13
