求助：PCR上下引物如何设计？

a279915845

我做的是大鼠诱导的iPS，想做PCR进行鉴定，上下引物该如何设计，求赐相关文献，初学者求赐教

nichifanlema2

回复 a279915845 的帖子% O' P0 V' z  H& {' B
& t, w( L( y0 p4 ~+ x) \
最好是用文章上现成的引物，直接让公司合成即可。如果想自己设计，需要查询到基因，然后可以利用软件如Primer 5或以上版本，设定参数后就可以。

Andyhigh

a279915845 发表于 2014-3-31 17:30
" G" C/ x' ]" w" }+ s我做的是大鼠诱导的iPS，想做PCR进行鉴定，上下引物该如何设计，求赐相关文献，初学者求赐教

6 }5 G* N9 H; e2 `2 E( m) t
我来回答下你的问题：
  K# _( H0 g) Q! l- C
, c, k8 Y4 y/ Z- K5 e! f1. 请说明你鉴定的目的；如你的问题给人以歧义，是想鉴定某个基因是否表达，还是想区分内 外源性基因是否表达或者沉默，让别人不知道如何回答你。
2 F; g2 |0 f- j; A& Q$ I
( S4 j5 X7 \) t2 y, ~4 \2.正如楼上所说，你可以找 文章中现成的引物，不过文章的质量最好高点，并且跟你的试验目的是一样的，同时注意种属问题。9 c- l8 Y" D; {4 w

) M3 c9 u1 [& m, r+ c3. 如果你想学习引物设计，你可以在百度搜索下，有很多这方面的基础知识，如引物设计的基本原则，另外还推荐几个论坛：小木虫、生物秀。 掌握基础知识后，最好找个会用PRIMER 的师兄师姐教你一下，这样上手就快了！
) _- ]2 q5 w& Y, X4 c& n1 d6 c/ @% |
补充内容 (2014-3-31 21:15):+ V# Q9 }1 x# o
还有丁香园你也可以关注下，这些东西就是要你静下心来好好学，上手还是很快的！！！

nines

大体上有以下原则：
, Y" e9 O$ ]' M; @* ?4 h* {: {8 o1 引物长度大于16bp,一般为20-24个核苷酸
4 Y7 U# M+ I2 G" E7 G" \2 引物与靶序列间的Tm值不应过低$ D7 q4 _+ j2 k6 B: s
3 引物不应有发夹结构。即不能有4bp以上的回文序列2 b) q) m8 ?2 h8 h( e
4 两引物间不应有大于4pb以上的互补序列或同源序列，在3’端不应有任何互补碱基
3 v6 V) J$ T1 j& Q; k: k! T5 引物中碱基的分布尽可能均匀，G+C含量接近50%0 T6 E' Q$ K4 ^- p4 Z
要先在NCBI上查找你的目的基因序列，然后用引物设计软件PRIMER（现在好像有PRIMER6了）等，也可以在线设计Primer3 – Free Online Primer Design Tool | PCR Primer Analysis Software5 m8 W* o$ o4 d7 b. Q8 e
http://simgene.com/Primer3；上面的参数不要改，设计出来会有好几对，让老板或者师兄师姐帮你看一下挑一个最合适的就行啊，然后送公司合成，很快的。

碧螺春的秋天

检测内源基因表达还是外源基因沉默？内源基因的话就在基因的上下游各按照楼上的描述设计引物，如果是外源基因沉默的话就在载体上游和基因下游设计引物，进行PCR检测。