求助：PCR上下引物如何设计？

a279915845

我做的是大鼠诱导的iPS，想做PCR进行鉴定，上下引物该如何设计，求赐相关文献，初学者求赐教

nichifanlema2

回复 a279915845 的帖子* k5 K$ x" M) ?9 h' [
. A8 U3 }$ U% B5 S' }+ F' E
最好是用文章上现成的引物，直接让公司合成即可。如果想自己设计，需要查询到基因，然后可以利用软件如Primer 5或以上版本，设定参数后就可以。

Andyhigh

a279915845 发表于 2014-3-31 17:30
) F: E& Q+ ]. A7 m! \我做的是大鼠诱导的iPS，想做PCR进行鉴定，上下引物该如何设计，求赐相关文献，初学者求赐教

  A6 N0 K7 K* E# P. y- o
我来回答下你的问题：
( g- r& t, V* E3 R2 g2 m5 \! U. R) j6 O3 D$ a
1. 请说明你鉴定的目的；如你的问题给人以歧义，是想鉴定某个基因是否表达，还是想区分内 外源性基因是否表达或者沉默，让别人不知道如何回答你。3 F2 [: b1 x+ s# G- P
+ r- n# [5 K) E3 k: w* c
2.正如楼上所说，你可以找 文章中现成的引物，不过文章的质量最好高点，并且跟你的试验目的是一样的，同时注意种属问题。
! n/ L9 \/ S- J% b4 D& R: D. J
1 B  d* F0 {' h- _2 l+ r3. 如果你想学习引物设计，你可以在百度搜索下，有很多这方面的基础知识，如引物设计的基本原则，另外还推荐几个论坛：小木虫、生物秀。 掌握基础知识后，最好找个会用PRIMER 的师兄师姐教你一下，这样上手就快了！5 b  ~* T2 |, m

! J( A- L3 H6 Q. K补充内容 (2014-3-31 21:15):! N/ Y9 Z7 l2 `+ R6 h7 u6 ^, N
还有丁香园你也可以关注下，这些东西就是要你静下心来好好学，上手还是很快的！！！

nines

大体上有以下原则：
# r- M% o" n' |' D$ I1 引物长度大于16bp,一般为20-24个核苷酸
5 i& k" {1 p$ P2 s# z5 H2 引物与靶序列间的Tm值不应过低  U. i9 i. Z" u
3 引物不应有发夹结构。即不能有4bp以上的回文序列
9 B) r/ ^( B- D: K4 两引物间不应有大于4pb以上的互补序列或同源序列，在3’端不应有任何互补碱基5 {9 ]0 O. O! B; n' G: x  F0 Y: A
5 引物中碱基的分布尽可能均匀，G+C含量接近50%; R6 T( |! E9 Z. B+ t$ E" h
要先在NCBI上查找你的目的基因序列，然后用引物设计软件PRIMER（现在好像有PRIMER6了）等，也可以在线设计Primer3 – Free Online Primer Design Tool | PCR Primer Analysis Software
3 {9 T: }8 @5 r6 T) L8 D/ _( O+ Mhttp://simgene.com/Primer3；上面的参数不要改，设计出来会有好几对，让老板或者师兄师姐帮你看一下挑一个最合适的就行啊，然后送公司合成，很快的。

碧螺春的秋天

检测内源基因表达还是外源基因沉默？内源基因的话就在基因的上下游各按照楼上的描述设计引物，如果是外源基因沉默的话就在载体上游和基因下游设计引物，进行PCR检测。