如何降低内毒素

石山巨石

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细菌内毒素一般会污染 细菌做载体的质粒DNA扩增产物 或者工业级别生产的蛋白质 （根据下游做什么 以下几点可省略 如果下游非常敏感 就稍微多注意一下）
* N/ E  k* s1 L; T1 H我们公司有配方去除内毒素 但是不是很方便* U4 f1 a) D" |0 [+ o/ w
不过 我可以提供一些思路 供大家参考 以及一些降低内毒素污染的操作细节) _/ {2 O5 u+ O% Z
1， 内毒素为细胞壁内脂多糖 在细菌裂解后大量释放于环境中 因此 细菌培养（伴随细菌死亡） 细菌离心（有条件 除内毒后的步骤换离心机 没有就用HCLO 酒精擦擦） 以及“细胞裂解”过程的房间 最好能和过柱子的房间分开
4 a2 V1 x! e- l0 d& s2， 细菌裂解液的容器 和后续的一定不能混 一定要换新的
/ O7 t& E& D$ \# A/ ~3， 即使如此 空气中还是大量存在内毒素的（可以 做对照试验elisa测，一个水有盖，一个无盖，过夜，elisa）过柱子的时候如果有条件在超净工作台（后续步骤 需要另外换一个超净台） 或者无菌室做就在无菌室做  没有条件 应该尽量避免空气流动 （比如这个时候 扫地 吸尘器 开空调） 虽然不开空调会很热& a, O2 s/ L, b- X, x/ F$ L
4， 过柱子之后洗涤过程 以及所有后续步骤的tips 容器 一定要事先elisa 测量 并且在超净台内进行  即使同一个厂家生产的东西 由于batch不一样 质量差异也会很大（我们公司被坑过几次，不过也看情况 有的可以接受 有的不行）1 ?5 a7 t9 s2 p3 R* u" t+ E; Q
5，使用的时候也要注意保持tips 离心管等洁净（事实上 保持器材洁净要比防止试验污染还要重要 器材脏了毁一堆试验  所以 我的东西是不能让别人用的 别人用了 我不放心 就会换新的） 保持洁净 不是去擦拭 而是防止被污染 （擦拭 有时候会更脏）/ X& L" k2 H  Z) x# u
6， 关于内毒素的去除， 脂多糖为疏水性分子 质粒DNA带负电 所以在污染/产率要求不高的时候 可以多用酒精洗" i! A( F7 K# G/ x
                                                                  如果样品少或者要求特别干净  用类似于肥皂的detergent （不是真的肥皂）不过要注意过柱子之后的酒精洗涤 浓度不能太高（容易污染） 也不能太低（去不干净） 避免污染样品
5 r3 z+ p+ n. `& z7， 如果要用自己配的BUFFER， 一定要事先测量内毒含量，如果存放时间久，要定期测量，注意密封
' ]) \4 I( u& c) ]8 ^8， 水。 水是最容易脏的，买来的机器净化 也不能完全相信，一定要定期检测，更换指定部件。买来的净化水也是需要测量的。 （除非你买医用蒸馏水，不过我们公司在转存医用蒸馏水之后 还是会测一下的）# I$ R& l% [; u0 E
9， 祝大家实验顺利 早日毕业。3 w! c8 n; {- i/ X* Q

石山巨石

Hint: : y9 g5 M6 K7 w" L) r
大部分endotoxin removal 都要求incubate on ice 这个过程 事实上是增加detergent在水里的溶解度 低温增加溶解度的detergent  

Tivah

感谢！" ?( q$ |6 D2 i) _
看来我们买了无内毒素的质粒大提试剂盒，还是等于在走廊里做单细胞qPCR

石山巨石

回复 Tivah 的帖子
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* [/ w7 _' d# M1 B9 _( I6 Z其实 大于0.1mg DNA 扩增的的时候 PCR效率就太低了 细菌的来的快 但是带内毒素 5 \' [% K% y+ z5 a  h* }8 [+ J) y
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试剂盒一般都有endotoxin removal 如过没有 完全可以买beads 自己做 或者用笨（毒死人不偿命）4 R/ Q: V1 |  u+ D+ f
; A. H3 Z+ a, P! V" o. Q5 _# B

加菲菲

写得较为全面，很受用呀，一般我们都是摇菌间和抽提间分开，然后后续的一些步骤都在超净台（预照三十分钟）中进行，拿出来离心时要注意封口就好了。因为前面许多步都有无水乙醇，所以前面的步骤不用太过担心。最后加的水一定要是事先分装好的高压消毒的无菌水，只要够细心一般都不会有问题的。毕竟是从细菌中抽提，还是要注意摇菌的质量，别有杂菌就好。

老十

学习了，很好