PBMC没有分离出来

thor0504

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% U* ~* R* v" J! b3 W; ]
4 E0 n; z8 O) R4 c具体的步骤呢？每步的离心力、时间、ficoll的用量分别是多少？有先分离血浆吗？

momoenn

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( B$ b. x! j' A- T5 J$ @100ml，沉降加密度梯度离心

momoenn

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! q9 O2 f' _3 W) r
9 Y, p3 \. g: ?$ I. y! O我们用的是ficoll

thor0504

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7 _- F% c/ p# h+ l, l" _6 [! W
9 X& {7 T- X! u取血量是多少？按照什么程序操作的？用的什么方法分离的？密度梯度还是别的？

Andyhigh

momoenn 发表于 2014-4-3 21:39 " p: n; O8 v4 h; P
今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个 ...

$ e2 o# w- E& \, B
能分享下protocol不，大家讨论下看问题出在哪了，我对这方面比较感兴趣！- z7 x7 _& H/ L( |! d' d) ?$ Z

6 q. i0 E5 X( ~# K首先上传一份我做小鼠脾脏淋巴细胞分离的方案，可能与你的不太一样：
( a9 U3 {; Q& Z8 x$ l( N2 W- Y! ^# @3 W' _6 G7 f
一、        溶液配制
6 k/ Y" K  [% `- ]1.  1.5M Nacl的配制：4.4g Nacl+50ml蒸馏水 充分溶解后过滤除菌。
2 O$ O( D7 g9 ]- ^. V8 J2.  0.15M Nacl的配制：去5ml 的1.5M Nacl，加45ml的蒸馏水稀释
6 M0 _+ M6 T) V1 u6 [: ?3、100%Percoll (6ml)： 5.4 mlPercoll母液+0.6 ml 1.5M Nacl溶液0 x. m% u! g) S" P
4、70% Percoll (6ml) :  4.2 ml100% Percoll+1.8 ml0.15M的Nacl 溶液。$ U- [; M+ B2 @! x' y
6、40%Percoll (3 ml)   1.2 ml100% Percoll+1.8 ml 0.15M Nacl 溶液。
8 N; Y% I# R. t  g7、        红细胞裂解液：索莱宝R1010。
: Y4 d& i7 B' F8、        6~8周龄雌鼠" f. T* o) O  c( ^5 g
9、        洗液：95% RPMI 1640+5% FBS +10 mM Hepes
8 `( E4 f8 L- T10、        增殖培养基：90% RPMI 1640+10% FBS +10 mM Hepes+双抗+2.5ug/ml ConA8 E1 H3 r) j. B
二 . 小鼠淋巴细胞的获取：7 P; A3 s) b1 z! V3 K
1、断颈处死小鼠，浸泡 于 75% 的乙醇中。+ Z5 M* o! y: C! s
2、在超净台中取出小鼠脾脏，将脾脏在预冷的洗液中洗1遍。5 T# Y2 t" P6 n3 ]
3、将脾脏转移至一个干净的6cm皿中，加入4ml预冷的洗液，皿放置于冰盒上，将10ml的注射器针头折弯成150度角。7 Q- `$ P8 H8 I! A3 [; z# ]
4. 先用针头在脾脏上扎孔，再用镊子固定脾脏，用针头挤压脾脏，将其中的细胞释放出来。
+ g: H' K- E; `: [  G+ V5 r5.. 将收集到的细胞悬液用200目的纱布过滤2次。
- C  `- R! [) A7 H  S4 e6. 过滤后的悬液1500 rpm离心3min，弃去上清，用3 ml 40%的percoll 重悬待用。" L  L  C2 P- W1 G
7. 取一个15ml的离心管，用1 ml的牛血清湿润试管壁，除去多余血清，再加入6m 70%的percoll。$ F; ]7 B8 j/ N; B7 i
8. 用巴斯德管吸取6中的细胞悬液，试管稍倾，在距离液面1cm处紧贴管壁任其自然慢慢流下，注意勿破坏分离层的界面。
/ D' w6 J! A, k9.再吸取1 ml的洗液铺于40% 的percoll上层。& Y: Y8 y: A* ]% ]$ l& a
10.将离心机的加速度调为0，在水平离心机上800g（我们的为2000rpm）室温（20度）离心20min。5 K4 ^' ^; i2 f/ t# G: o7 }
11.吸取40% percoll和70%percoll之间的细胞，加入5ml洗液，离心去上清。/ @2 o& T0 b; v* D5 ~1 o
12. 向细胞沉淀中加入3ml的红细胞裂解液，转移至6 cm皿中，冰盒上孵育4min，再加入6ml洗液稀释裂解液，1500 rpm 4度 离心3min，弃上清。
# x; v6 T- S- y' U: ~& a13. 用洗液洗涤2遍后，培养液重悬待用。7 C! B+ j% |# T# K7 p- n

$ y+ Z) V, u! B2 M, p
" f# l% a2 N: T+ N; H