PBMC没有分离出来

momoenn

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今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个核细胞。大侠们遇到过这种情况吗？在线等待。

Andyhigh

momoenn 发表于 2014-4-3 21:39
$ F) H+ g4 |7 ~$ L今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个 ...

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能分享下protocol不，大家讨论下看问题出在哪了，我对这方面比较感兴趣！
" \8 f$ D8 E1 g5 C
: b5 h/ u5 m/ |" [  G' a5 M1 F首先上传一份我做小鼠脾脏淋巴细胞分离的方案，可能与你的不太一样：
/ V% k7 C) X- l8 D& [+ g
. U" n; c# b8 M8 V9 U, w一、        溶液配制
/ V) w* @3 x$ X2 [+ R1.  1.5M Nacl的配制：4.4g Nacl+50ml蒸馏水 充分溶解后过滤除菌。" U. B, M) ?, q) Z3 Q. N: M. u% F* }9 ^
2.  0.15M Nacl的配制：去5ml 的1.5M Nacl，加45ml的蒸馏水稀释* m) n5 i  o$ a$ G, J5 h
3、100%Percoll (6ml)： 5.4 mlPercoll母液+0.6 ml 1.5M Nacl溶液: ~8 r1 r! l0 M3 K+ X2 o, m: t7 {
4、70% Percoll (6ml) :  4.2 ml100% Percoll+1.8 ml0.15M的Nacl 溶液。2 N# i3 {3 s4 p( o- W! K9 @; J7 ^/ s' G
6、40%Percoll (3 ml)   1.2 ml100% Percoll+1.8 ml 0.15M Nacl 溶液。
( ~2 V/ f& m6 |% @' N7、        红细胞裂解液：索莱宝R1010。
1 K; M" \% _4 i: Q4 y6 E) U8、        6~8周龄雌鼠
9 Z% j( ]; D9 |  C9、        洗液：95% RPMI 1640+5% FBS +10 mM Hepes
4 {/ z  W! H' i% q+ A6 J: ^5 y10、        增殖培养基：90% RPMI 1640+10% FBS +10 mM Hepes+双抗+2.5ug/ml ConA
- M6 D5 z5 V  T3 R! I& b! R二 . 小鼠淋巴细胞的获取：
/ N, e5 j: m9 f; d, ?5 P1、断颈处死小鼠，浸泡 于 75% 的乙醇中。
# H2 ~$ U) [. I2、在超净台中取出小鼠脾脏，将脾脏在预冷的洗液中洗1遍。. M% p& D2 o+ n4 R0 o( {
3、将脾脏转移至一个干净的6cm皿中，加入4ml预冷的洗液，皿放置于冰盒上，将10ml的注射器针头折弯成150度角。
) L6 I5 m7 B9 s& Z" j5 W4. 先用针头在脾脏上扎孔，再用镊子固定脾脏，用针头挤压脾脏，将其中的细胞释放出来。
0 o1 ]8 U0 Z  t1 ^9 O* B" ]5.. 将收集到的细胞悬液用200目的纱布过滤2次。
; K( U# S: J, [/ N' Z4 v4 o6. 过滤后的悬液1500 rpm离心3min，弃去上清，用3 ml 40%的percoll 重悬待用。
9 b% K8 M9 }9 t# h7. 取一个15ml的离心管，用1 ml的牛血清湿润试管壁，除去多余血清，再加入6m 70%的percoll。
6 D0 l% g! e/ m4 u1 L# k  ?8. 用巴斯德管吸取6中的细胞悬液，试管稍倾，在距离液面1cm处紧贴管壁任其自然慢慢流下，注意勿破坏分离层的界面。2 v1 H: d4 {- Y- C) s# l
9.再吸取1 ml的洗液铺于40% 的percoll上层。/ \! c) Q5 u. k1 @& n
10.将离心机的加速度调为0，在水平离心机上800g（我们的为2000rpm）室温（20度）离心20min。! j* q6 ?* S! ^9 L: J0 E: ?
11.吸取40% percoll和70%percoll之间的细胞，加入5ml洗液，离心去上清。( N9 y, F0 x" Z2 n
12. 向细胞沉淀中加入3ml的红细胞裂解液，转移至6 cm皿中，冰盒上孵育4min，再加入6ml洗液稀释裂解液，1500 rpm 4度 离心3min，弃上清。3 \  z- A* b; k' X# s
13. 用洗液洗涤2遍后，培养液重悬待用。$ N) A. ?" S& J1 T/ P- \5 m' ^; k0 p
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thor0504

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: u. P9 a/ _6 q+ d2 |' K+ i+ A9 E1 ]" N' ?+ @. c) l9 }
取血量是多少？按照什么程序操作的？用的什么方法分离的？密度梯度还是别的？

momoenn

回复 Andyhigh 的帖子' J. ?# g+ U0 ^. ?: L0 C" `

1 W) i! E7 Q4 o5 G; |我们用的是ficoll

momoenn

回复 thor0504 的帖子% M; L% U" N1 a9 v
6 d. o6 H& ~4 Z  W7 _
100ml，沉降加密度梯度离心

thor0504

回复 momoenn 的帖子! o5 z, h) d3 ]$ W

9 F( Q! w+ k' A具体的步骤呢？每步的离心力、时间、ficoll的用量分别是多少？有先分离血浆吗？

heirrii

100ml外周血，应该能分很多啊

heirrii

血液先稀释没

levell

血液细胞用PBS稀释后加入到淋巴细胞分离液上，离心，注意离心加速度调到最低，很关键，不然起步和停止速度过快就会把液面打散了
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weijunning

回复 momoenn 的帖子  }: h6 q7 o& Y$ P

9 q7 Q: e2 \  t& G请问这个病人是什么病人？如果是癌症患者，无动员直接从上肢静脉抽血，很难获得足够数量的PBMC，有的血象差的病人基本上分离不到白膜层。所以，建议还是先动员一下再采血比较好。