PBMC没有分离出来

Andyhigh

momoenn 发表于 2014-4-3 21:39 & k# \5 r; g+ S, z
今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个 ...

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能分享下protocol不，大家讨论下看问题出在哪了，我对这方面比较感兴趣！4 j4 ?( D& U7 j" [9 ~" l4 t$ M6 p! e
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首先上传一份我做小鼠脾脏淋巴细胞分离的方案，可能与你的不太一样：. G8 p7 B# n$ V% T9 I- u
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一、        溶液配制! V1 d# F" H" T' K  m
1.  1.5M Nacl的配制：4.4g Nacl+50ml蒸馏水 充分溶解后过滤除菌。( |9 ^2 O/ R8 c7 a8 `3 D: c; h" h4 S
2.  0.15M Nacl的配制：去5ml 的1.5M Nacl，加45ml的蒸馏水稀释7 K/ r2 i! A# C
3、100%Percoll (6ml)： 5.4 mlPercoll母液+0.6 ml 1.5M Nacl溶液1 M! R+ O! Z5 Q- Q- T8 D
4、70% Percoll (6ml) :  4.2 ml100% Percoll+1.8 ml0.15M的Nacl 溶液。
& I4 B$ W" R& M6、40%Percoll (3 ml)   1.2 ml100% Percoll+1.8 ml 0.15M Nacl 溶液。3 L" [1 e8 [5 Q; L! q/ o
7、        红细胞裂解液：索莱宝R1010。
) a/ x0 [( m) E; j8、        6~8周龄雌鼠! E0 V9 ^/ y, `% u* o, w
9、        洗液：95% RPMI 1640+5% FBS +10 mM Hepes; H1 I# d6 N$ X! {* }/ s9 a! @
10、        增殖培养基：90% RPMI 1640+10% FBS +10 mM Hepes+双抗+2.5ug/ml ConA
. N( O8 U( C4 U/ m$ C; ~+ C- H* C二 . 小鼠淋巴细胞的获取：
/ S* ^- p, }# w. G1、断颈处死小鼠，浸泡 于 75% 的乙醇中。3 O. B" z9 s0 i) @: d3 T, L7 d
2、在超净台中取出小鼠脾脏，将脾脏在预冷的洗液中洗1遍。. D. L8 D# m" i% a- ^
3、将脾脏转移至一个干净的6cm皿中，加入4ml预冷的洗液，皿放置于冰盒上，将10ml的注射器针头折弯成150度角。2 ^, T0 R5 `  F# H( g9 ]( P. P# N
4. 先用针头在脾脏上扎孔，再用镊子固定脾脏，用针头挤压脾脏，将其中的细胞释放出来。
7 ?7 F+ r( \" C' L0 V$ Q5.. 将收集到的细胞悬液用200目的纱布过滤2次。! o4 C0 ^6 d9 i
6. 过滤后的悬液1500 rpm离心3min，弃去上清，用3 ml 40%的percoll 重悬待用。
2 d4 W7 A6 w/ ^* s" d7. 取一个15ml的离心管，用1 ml的牛血清湿润试管壁，除去多余血清，再加入6m 70%的percoll。* H; S, H+ q8 F0 L5 U6 J
8. 用巴斯德管吸取6中的细胞悬液，试管稍倾，在距离液面1cm处紧贴管壁任其自然慢慢流下，注意勿破坏分离层的界面。
, O  }) P4 F/ u6 a9.再吸取1 ml的洗液铺于40% 的percoll上层。/ R" b0 u) C' L  r. H% K
10.将离心机的加速度调为0，在水平离心机上800g（我们的为2000rpm）室温（20度）离心20min。
0 a; n1 l. k2 [, K2 r11.吸取40% percoll和70%percoll之间的细胞，加入5ml洗液，离心去上清。& M% D6 k# o6 s* J
12. 向细胞沉淀中加入3ml的红细胞裂解液，转移至6 cm皿中，冰盒上孵育4min，再加入6ml洗液稀释裂解液，1500 rpm 4度 离心3min，弃上清。, Q* B7 a2 [% [: F9 k! f7 S
13. 用洗液洗涤2遍后，培养液重悬待用。
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