细胞污染问题

Blackangel

如题，想请教一下大家关于细胞污染方面的问题。3 M9 J$ L% H. D  _# B
首先，讲下自己遇到的问题。昨天晚上细胞出现接触抑制（有一个复孔，共两孔，六孔扳养的细胞），于是将一孔细胞进行传代，另外一皿细胞继续培养。今天发现细胞大部分已污染，判定指标为贴壁细胞已飘起。于是想请教下关于污染方面的问题。
& [/ d( m, G, V$ P  `1. 如何判断细胞是否污染？实验室有人说，在高倍镜下看是否有游动的物质，如有则为污染！但这样感觉不是很方便，且不能每次细胞都弄到高倍镜下仔细观察。此外，感觉也不是很准确。
) J0 n* @/ V( b$ W5 ^3 F$ K2. 污染后，大概多长时间能明显观察到细胞已污染（如细胞已死亡，贴壁细胞已飘起），个人感觉应该按照污染源的不同，而进行具体的区分，望高手解答下。
7 ]8 x3 M, q+ i        自己也分析了下原因：1. 细胞中加了一些蛋白（自己生产）处理，担心蛋白带来了污染问题。但自己加了三天（每天更换一次），发现污染为第四天，第三天细胞均正常。2. 虽说养细胞有段时间了，想想昨天也不能完全排除操作的原因。于是，想高手替我解答下问题。

michaelgibh

细胞污染一般有三种情况，主要有真菌感染，细菌感染，支原体感染。
" i; Y  p9 n8 s5 X% r经常发生的就是细菌污染。细菌污染24小时后培养基颜色会变化，很容易看出来，如果是支原体污染就看不出了培养基颜色变化了但是细胞长的很慢。即使在低倍镜下观察仔细点也能看的出来。做细胞实验最重要的就是显微镜下多看了，这都嫌不方便！！

Andyhigh

michaelgibh 发表于 2014-6-22 23:50 , e# z- s$ j# W
细胞污染一般有三种情况，主要有真菌感染，细菌感染，支原体感染。% u( a; o" p/ ?. k5 a) b4 X
经常发生的就是细菌污染。细菌污染24小 ...

0 \5 i' J) a/ V: Z. T如果是支原体污染，除了细胞生长缓慢，还有其他什么特征嘛？在低倍显微镜下又主要观察哪些指标呢？

michaelgibh

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7 _: p3 l& R: G1 @- V3 T; N$ Y. |; L回复 Andyhigh 的帖子% n. _' E4 V) [: d6 z& v' i' K' \
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支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细胞，也不同于病毒。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长，营养要求比细菌高。% ?! o* n, g9 Y' h: U6 z" g
细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，支原体感染发生后能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达，又不能通过可视法对其进行检测，而且它对细胞的生长率影响较小，不易引起注意。国内外研究表明，95％以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆甾原体（A.laidlawii），为牛源性。以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。
, h$ l' U% f. k2 R' h支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。2 E  y3 G; H+ }( s/ c" V
组织细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍耐药。对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。
% W8 Q8 v, M/ h2 w+ L' A3 Z红霉素有效，而且不影响细胞生长。我的细胞刚开始被支原体污染，细胞生长极为缓慢，而且状态不好，细胞之间及底部总有一些亮晶晶的颗粒状物质，换液后好些，但过2天又会增多，培养液清亮，严重时象一层细沙铺在瓶底。刚开始以为是消化过头引起的细胞的碎片和细胞内的颗粒，后来发现与胰酶消化无关。使用红霉素（就在医院的门诊购买，很便宜）后这种现象明显好转，背景干净，细胞生长很快，状态明显好转，但好像红霉素不能完全根治支原体感染，停药后一段时间可以复发，热灭活可以试试，41度10个小时，可以杀死支原体，是一种比较简单的方法，对细胞损伤不大。5 \. F1 d6 A! Y9 P0 W! z
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+ B, W" D- }0 ~% c' R% _% w支原体是细胞培养中最常见的，干扰实验结果的一种污染。但由于不易被察觉，有些污染的细胞仍在继续使用。据查，目前各实验室使用的二倍体细胞和传代细胞中约有11%的细胞受到支原体污染。因此，对支原体污染应严加防范。
5 c: m0 Y6 u0 E. v( k用卡那霉素预防支原体污染有效。
. h, ]) `3 M, u& K检测方法：. A2 o% }% R$ w" L9 I- ?) `
1 相差显微镜检测；2 低张处理地衣红染色观察； 3 DNA荧光染色法；4 电镜检测；5 3-H胸腺嘧啶掺入法； 6 聚合酶链反映法； 7 免疫学方法； 8 支原体的培养。
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" s" ~  _, n" W对于支原体污染的细胞，可以采取补救措施：; t- p8 |- q5 f4 N  t
1 抗生素排除法：可以用5-10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24-48小时，再换入常规培养液，有时可能有效。推荐用量：庆大霉素 200ug/ml ,四环素10ug/ml ，卡那霉素50ug/ml 。对于支原体污染抗生素应用，预防性应用比污染后使用好。
, g9 l( B7 o' E+ l9 }3 t* O2 加温除菌：根据支原体耐热性能差的特点。将受支原体污染的细胞置于41度中作用5-10小时可以杀灭支原体。但由于41度对培养细胞本身也有较大的影响，故处理前，应先进行预试验，确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。 3 M( U  A  d$ T
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这里说的详细些。我们在培养细胞的时候如果感觉状态变差了，会去做支原体检测。

康小纬

一般细菌污染24小时以后，培养基的颜色会变黄并且非常的浑浊，用肉眼很容易观察出来，而真菌污染在显微镜下可以看到一团丝状的东西，它一般是在某一个地方而不是整盘都有，至于支原体污染我还没有遇到过，但是据说细胞会长的慢，并且状态不好，我现在就遇到这个问题，我在用G418筛选单克隆，克隆长的很慢，而且还没有长到很大就状态不好了，一直找不到原因，我现在也应该检测一下是否支原体污染

青云之上

细胞污染最常见的就是细菌和真菌，一旦被这俩污染，显微镜下都很壮观，一个游来游去，活体四射，一个张牙舞爪，组团出游，且培养基会明显发生变化，一是颜色，一是清澈度；支原体污染是个全球性问题，普通镜下很难检出，从形态和培养基也不易看出，目前最有效的检测手段是用试剂盒，很多公司都有支原体检测试剂盒，方便快捷很好用~~~

碧螺春的秋天

支原体污染的话要进行专门的检测；细菌和真菌在镜下看或者看培养基，已经很方便了；污染不一定是当天污染第二天就显出来，所以有时候无法确定是什么时候污染的，它到一定数目才会爆发出来，看见污染就迅速处理掉吧

gzeb

细胞培养污染原因很多的，污染源的话，细菌真菌最多了，而且也很好判断
& B# L6 D' d( w  e$ E9 T细菌污染：污染严重的话，肉眼就能看到培养基浑浊，变色，显微镜下游动的小东西那是相当多的，看仔细点就能看到（低倍镜下就能看到）。一般如果出现污染，一个晚上就会很严重。处理方法——PBS清洗，加双抗处理（根据双抗浓度不同，处理时间不一样），之后再清洗一次，继续培养，如果次日还是未能解决，如果实验允许带双培养细，就带双抗培养，不行的话，细胞只能废弃掉了，重来吧
- e- I8 X) B% e. t3 I5 ~真菌污染：肉眼成斑，显微镜下局部丝状成团。一般出现这种污染加两性霉素处理下吧，加这个对细胞也是有影响的，所以细胞不贵重就算了，扔了吧，加强操作。
8 u6 J& p+ ]- V  Q/ T( I/ M支原体污染：肉眼、显微镜下就不可见的，需要试剂盒检测，一般是因为血清等试剂引起的。; U0 ~, c: R* S9 D
出现你这种情况污染，最大可能就是操作上的问题，先请教下你同实验室工作比较久的操作人员吧，让他看看你细胞培养过程，帮你指点，每个人操作习惯不同，污染风险不同，也许你的操作习惯就很容易引起污染，所以在同等培养环境下，让这些资深点的操作人员帮你指点是最有效的; b: O6 M! m# l1 _* m

牵着蜗牛去散步

支原体在显微镜是观察不出来的，细菌污染培养箱内会有异味，并且培养基会变浑浊，据你所说的，应该是加入的定西造成的污染，加入的东西含菌，但是量很少，长到3,4天就会大规模的出现，短暂细菌达不到一定的量，是不易观察到的。你的操作一般是没有问题的

gghywtfz

青云之上 发表于 2014-6-23 09:56 & B9 `4 |/ [8 _( s) V# n0 h+ @" E
细胞污染最常见的就是细菌和真菌，一旦被这俩污染，显微镜下都很壮观，一个游来游去，活体四射，一个张牙舞 ...

( d( `8 ~3 d" S% A: ^- x
哈哈，这个好好玩的说。' [# A  D0 q) C3 ]
: C. L9 r$ i) A' N2 U- s
游来游去，活体四射，张牙舞爪，组团出游
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很形象哈