关于CFU，成集落培养的问题

子非鱼

脐带间充质干细胞的集落应该是用液体培养基吧。成品的甲基纤维素培养基的分装的话，考虑种植时的损耗就分1ml一管，不考虑就可以分900ul一管。

子非鱼

你现在是不是有一瓶甲基纤维素的培养基的体系啊？B cell的集落培养体系好像也是甲基纤维素的培养基，但是当时因为一些原因，我没有认真看产品的资料，所以也不确定。但是我们用的甲基纤维素的培养体系中有长出过间充质干细胞，但是不是聚集状的，所以间充质干细胞的集落应该是不行的。# t" U  w/ d6 s" g& a2 B. f2 Z
你说的二倍培养，三倍培养是集落培养中的吗？我没有听过，只知道原代集落的二次铺板。% v/ Q* ~7 e7 o8 g$ a; ^5 t
我是个渣渣，所以很多了解的都不全面。

子非鱼

我主要也是做的造血干细胞的集落。* V# d8 \" O) @* s* y, w, s+ X
我贴一下我在书上看到的集落重铺的内容，因为书上是讲自己配集落体系的情况，所以你斟酌着看吧。
6 Q$ p7 w/ U6 S  \+ T集落重铺
5 h! }0 f1 e: r7 L    注意：该技术只适用于使用甲基纤维素培养的原代细胞。琼脂培养基过于坚硬，极其难将其中的集落挑出进行二次铺板培养。若要将CFU-GM的原代集落进行二次铺板培养，只需将琼脂替换为甲基纤维素，并将2×McCoys替换为IMDM。
* p5 V, N- S' u+ _2 c材料/试剂. s8 l8 N+ ~: O5 b% d- @
除非特别说明，所有材料均需灭菌
# H( ^$ c  @7 S" Q/ P3 ]9 c. `(1)        带通风设备的超净台# J# I3 b$ Y5 t5 J6 n' H5 X
(2)        倒置显微镜
, V( p- F) G% g/ n(3)        20ul微量移液器
9 {8 ], n8 e2 Z" X+ L$ ^% p(4)        含青霉素/链霉素的IMDM
" r, Y8 Z3 {1 ~: n(5)        12mm×75mm聚丙烯试管5 f& T" a9 |( G, A
收集集落步骤1 o/ u  y% G9 Y, ]" ~
所有步骤均需无菌操作。
7 z' {+ n0 O/ }(1)        确定需要进行二次培养的集落数目。每个集落准备一只试管，加入100ul含有2%FBS的IMDM，拧紧盖子。9 U" {7 }& {& ~$ o' V) c, k
(2)        将显微镜放置在有通风设备的超净台中。% S# |% O0 B4 a
(3)        将含有待收集集落的平板置于显微镜的载物台上，固定平皿并移去平皿盖。* m9 [- q7 H1 r; Y1 y# l6 T
(4)        如果显微镜没有配置平皿固定装置，可将胶带的黏面向外环成一个圆圈，将两个这样的圆圈粘在载物台上，将平皿置于其上，同样能达到固定的目的。; y# g& Q" G+ W6 ]; f7 i; X$ u
(5)        找到目的集落后，用20ul移液器轻轻吸出集落。" j5 v6 Q- j( w! ^5 J9 c
(6)        单独存在的集落最容易收集。
/ {+ Z4 [7 y  s' q/ Y8 J( I: E(7)        将集落转移到（准备好的）含100ulIMDM培养基的试管中，吹吸数次以清洗吸头。4 f- E; \" l% T8 [* v+ V
(8)        集落收集完毕后，进行铺板操作。
! D5 J1 y. s* x) m4 n集落收集后的铺板步骤
) `/ t! I, ?- i0 h所有步骤均需无菌操作# I! `8 t5 H, m/ u6 {9 I+ m
(1)        计算收集到的集落数，按每个集落1.1ml的量准备培养基混合液（包括甲基纤维素），静置使气泡溢出。% H4 _% E) u/ I4 M9 g! u
例如，如果你从含有IL-3、Epo和SCF等生长因子的平皿中收集了100个集落，那么就准备110ml培养液，所用生长因子与原始平皿中的相同，并在加入细胞之前加入甲基纤维素。0 O& I' I+ e, p% J4 ~& q6 m) p
(2)        当培养液澄清后，用配用16口径（gauge）针头的3～10ml注射器，向每个已含有收集到的集落的试管中加入1ml，振荡混匀。$ t  c. O' A* ~8 I: g
(3)        静置。2 k! o/ M4 _  \4 q+ _
(4)        将上述混合液倒入新的35mm平皿中，转动使液体覆盖平皿。
8 t, v( s* F; r$ a甲基纤维素比较黏稠，总会有培养液残留在试管中，因此不能100%重铺所有集落中的细胞。如果你的实验需要定量计算最后的结果，可以加入一定比例的培养基混合液，通过矫正计算进行统计。例如，加入1.1ml（1ml培养基+0.1ml收集的集落）培养基混合液中的0.9ml，所得的二代集落数则大致代表了全部集落中82%的集落生成细胞。
2 w/ X" F4 h7 n(5)将平皿放在37℃、5%CO2/O2的湿润环境中培养14d.
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