关于CFU，成集落培养的问题

洛古16

请问，各位大神，
: N* E1 B# {* p6 W; C1 m/ N% ^1、脐带间充质干细胞能进行甲基纤维素的成集落培养嘛？
+ h/ F: N$ P8 p# A3 t2 ?2、成品的甲基纤维素培养基100ml，一般分装多少ml一管呀？

子非鱼

脐带间充质干细胞的集落应该是用液体培养基吧。成品的甲基纤维素培养基的分装的话，考虑种植时的损耗就分1ml一管，不考虑就可以分900ul一管。

洛古16

回复 子非鱼 的帖子9 D% }7 q) \( W4 X' F# r
, e( r3 c" N5 p( A% K5 k" \
甲基纤维素的培养基只能用来检测造血干细胞，祖细胞的分化潜能么？8 X5 N- x, X% n5 U! }
培养当中的二倍培养，三倍培养是什么意思呢？
/ \( A9 G$ S* M7 N) G还望不吝赐教啊，谢谢

子非鱼

你现在是不是有一瓶甲基纤维素的培养基的体系啊？B cell的集落培养体系好像也是甲基纤维素的培养基，但是当时因为一些原因，我没有认真看产品的资料，所以也不确定。但是我们用的甲基纤维素的培养体系中有长出过间充质干细胞，但是不是聚集状的，所以间充质干细胞的集落应该是不行的。
* J6 T5 d. o) B, O4 k& q你说的二倍培养，三倍培养是集落培养中的吗？我没有听过，只知道原代集落的二次铺板。
+ |3 ], l  j* B; g3 O+ d: M我是个渣渣，所以很多了解的都不全面。

jjjddf

我们分装一般是十五毫升，但是要看你的使用量来算

洛古16

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5 u$ w4 ]0 S" g- X8 N6 I0 U; Z$ D% T; T0 s: H5 s
有，STEMCELL的含有因子，木有EPO的培养基。
) {8 s; g# A, m. T那，原代集落的二次铺板是怎么操作法呀？
! l$ |* i; X  `1 w2 G  e6 Y刚涉及成集落培养，看那个说明书好多都不认识。

子非鱼

我主要也是做的造血干细胞的集落。7 N' A8 ]3 P, h; A* I  n
我贴一下我在书上看到的集落重铺的内容，因为书上是讲自己配集落体系的情况，所以你斟酌着看吧。
* o7 A( z5 t, y% n" u; {集落重铺7 }, d; O3 A% Q7 `4 U
    注意：该技术只适用于使用甲基纤维素培养的原代细胞。琼脂培养基过于坚硬，极其难将其中的集落挑出进行二次铺板培养。若要将CFU-GM的原代集落进行二次铺板培养，只需将琼脂替换为甲基纤维素，并将2×McCoys替换为IMDM。
8 @- G0 O( `- P$ C; Y材料/试剂
- y% l8 k+ v6 ^9 I除非特别说明，所有材料均需灭菌
+ s1 n, }* i; N) V/ z(1)        带通风设备的超净台
  w+ T1 y/ g: i" L(2)        倒置显微镜5 D$ f6 p( _4 |" o
(3)        20ul微量移液器( Q, i$ g3 Y. O& _- L
(4)        含青霉素/链霉素的IMDM
4 v- I- a: S) _3 X3 }& X7 J(5)        12mm×75mm聚丙烯试管
% W! h- M/ F- G- ]3 a- R收集集落步骤
+ h  k( s; v* C  M6 e( r. E  p所有步骤均需无菌操作。
. X8 f, L6 K3 r, \% m; O* I(1)        确定需要进行二次培养的集落数目。每个集落准备一只试管，加入100ul含有2%FBS的IMDM，拧紧盖子。
+ {. ]% z7 z  S(2)        将显微镜放置在有通风设备的超净台中。; {3 t, j( k+ G0 O; v" b  U, i. {
(3)        将含有待收集集落的平板置于显微镜的载物台上，固定平皿并移去平皿盖。
. R  O# L7 X5 |(4)        如果显微镜没有配置平皿固定装置，可将胶带的黏面向外环成一个圆圈，将两个这样的圆圈粘在载物台上，将平皿置于其上，同样能达到固定的目的。) o6 g% E; J9 t9 u- D
(5)        找到目的集落后，用20ul移液器轻轻吸出集落。
, f" z# s3 T8 q* f$ `(6)        单独存在的集落最容易收集。
2 N% l9 x& O6 U& g- M* l3 G3 E(7)        将集落转移到（准备好的）含100ulIMDM培养基的试管中，吹吸数次以清洗吸头。
5 d0 L& z# a% t# _/ r8 G2 I(8)        集落收集完毕后，进行铺板操作。1 M) u9 m7 D3 @2 o. j- O
集落收集后的铺板步骤. j9 t, L' I& q1 q. G
所有步骤均需无菌操作. G/ t2 V# X6 \. n- ^5 z
(1)        计算收集到的集落数，按每个集落1.1ml的量准备培养基混合液（包括甲基纤维素），静置使气泡溢出。
/ I% s; x+ e$ {+ }2 G4 h例如，如果你从含有IL-3、Epo和SCF等生长因子的平皿中收集了100个集落，那么就准备110ml培养液，所用生长因子与原始平皿中的相同，并在加入细胞之前加入甲基纤维素。) U- l' _8 L3 H: |2 e
(2)        当培养液澄清后，用配用16口径（gauge）针头的3～10ml注射器，向每个已含有收集到的集落的试管中加入1ml，振荡混匀。, j& O* ~1 ^8 [, w" ], e0 g' s
(3)        静置。
, a( T- P5 @+ j% W3 N( t6 E0 H3 L(4)        将上述混合液倒入新的35mm平皿中，转动使液体覆盖平皿。
7 f& I) _1 w. z0 q& L% C甲基纤维素比较黏稠，总会有培养液残留在试管中，因此不能100%重铺所有集落中的细胞。如果你的实验需要定量计算最后的结果，可以加入一定比例的培养基混合液，通过矫正计算进行统计。例如，加入1.1ml（1ml培养基+0.1ml收集的集落）培养基混合液中的0.9ml，所得的二代集落数则大致代表了全部集落中82%的集落生成细胞。; b+ f3 X1 x4 ?  g# c
(5)将平皿放在37℃、5%CO2/O2的湿润环境中培养14d.7 L/ m3 F6 i" t) i

洛古16

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% |! h! v8 }* r/ d# |3 W& C0 S8 y* O/ T
哈~~~非常感谢

洛古16

回复 jjjddf 的帖子4 Y; F6 r$ D9 N3 J& V: L' \7 m, H
/ v5 H  M9 ^' k; }3 Q& z7 k
15ml啊，那用什么分装呀，注射器还是吸量管啊

jjjddf

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  \7 [' v" d. }- A
9 ~' A' m8 Q% [/ |我们用的是吸量管