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我主要也是做的造血干细胞的集落。" q: s& _* q, ]! p% u: i
我贴一下我在书上看到的集落重铺的内容,因为书上是讲自己配集落体系的情况,所以你斟酌着看吧。3 `& N- h$ L6 o3 \1 V% t6 o
集落重铺 k6 x+ I; H9 s2 G6 Y @: e; q9 E7 v
注意:该技术只适用于使用甲基纤维素培养的原代细胞。琼脂培养基过于坚硬,极其难将其中的集落挑出进行二次铺板培养。若要将CFU-GM的原代集落进行二次铺板培养,只需将琼脂替换为甲基纤维素,并将2×McCoys替换为IMDM。' W7 X9 T+ G& [9 f c7 v
材料/试剂
1 c9 f4 k. D5 q除非特别说明,所有材料均需灭菌
6 E* ^' @# N5 |(1) 带通风设备的超净台
0 w4 x) ?' g0 y. @8 X% p(2) 倒置显微镜+ ?" q7 { h5 o Q# _( o7 x
(3) 20ul微量移液器- q4 p: \$ D! c' m7 y: n+ f8 M+ G
(4) 含青霉素/链霉素的IMDM' @2 I/ g0 u% W5 Z/ h* r8 E& W) X7 S
(5) 12mm×75mm聚丙烯试管
' R% b$ x1 a ~9 C, y: v0 M2 W$ M7 U收集集落步骤
. I( Q% v9 u4 p9 N* N a7 s: ~所有步骤均需无菌操作。
; o8 p, C# n7 f1 o6 h: S+ V2 m, o(1) 确定需要进行二次培养的集落数目。每个集落准备一只试管,加入100ul含有2%FBS的IMDM,拧紧盖子。
o( S$ @9 K; ]# L" u! N(2) 将显微镜放置在有通风设备的超净台中。
# R+ p# }1 k8 V6 T. v; R(3) 将含有待收集集落的平板置于显微镜的载物台上,固定平皿并移去平皿盖。
$ g8 d, ~) R0 ^* u# c: A1 d) s(4) 如果显微镜没有配置平皿固定装置,可将胶带的黏面向外环成一个圆圈,将两个这样的圆圈粘在载物台上,将平皿置于其上,同样能达到固定的目的。
6 w5 S7 z( s+ a: E6 ^(5) 找到目的集落后,用20ul移液器轻轻吸出集落。; c4 P) J, @, }% e% c1 w$ u" [
(6) 单独存在的集落最容易收集。
* M6 T. Z& H7 J" c4 H7 Y: V$ g(7) 将集落转移到(准备好的)含100ulIMDM培养基的试管中,吹吸数次以清洗吸头。
# N/ c4 _. m# E) u9 N4 @* Q(8) 集落收集完毕后,进行铺板操作。8 y7 |, Y+ Z4 R9 L: T8 ~ {
集落收集后的铺板步骤4 V; Q1 y$ I8 w, o, W
所有步骤均需无菌操作: I( e F. c( b6 M' A+ Q0 j2 \
(1) 计算收集到的集落数,按每个集落1.1ml的量准备培养基混合液(包括甲基纤维素),静置使气泡溢出。% a! Y" n; x4 v% M' M6 G0 k
例如,如果你从含有IL-3、Epo和SCF等生长因子的平皿中收集了100个集落,那么就准备110ml培养液,所用生长因子与原始平皿中的相同,并在加入细胞之前加入甲基纤维素。2 i; ?! p' n* C) h4 G% O
(2) 当培养液澄清后,用配用16口径(gauge)针头的3~10ml注射器,向每个已含有收集到的集落的试管中加入1ml,振荡混匀。1 i% X H k% y( `* n; _
(3) 静置。" ^7 V; Y: q7 o8 ^. g7 [1 r
(4) 将上述混合液倒入新的35mm平皿中,转动使液体覆盖平皿。5 p& `' j: ?; C, D( W9 z
甲基纤维素比较黏稠,总会有培养液残留在试管中,因此不能100%重铺所有集落中的细胞。如果你的实验需要定量计算最后的结果,可以加入一定比例的培养基混合液,通过矫正计算进行统计。例如,加入1.1ml(1ml培养基+0.1ml收集的集落)培养基混合液中的0.9ml,所得的二代集落数则大致代表了全部集落中82%的集落生成细胞。/ b& q9 H% a6 r0 I
(5)将平皿放在37℃、5%CO2/O2的湿润环境中培养14d.7 h; w% N V' Q: {7 P$ |5 n
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