关于CFU，成集落培养的问题

洛古16

请问，各位大神，" t7 [+ e6 N* I2 ]' _- f
1、脐带间充质干细胞能进行甲基纤维素的成集落培养嘛？
, x. E3 ]( K/ L& H. ~# P. g1 R2、成品的甲基纤维素培养基100ml，一般分装多少ml一管呀？

子非鱼

脐带间充质干细胞的集落应该是用液体培养基吧。成品的甲基纤维素培养基的分装的话，考虑种植时的损耗就分1ml一管，不考虑就可以分900ul一管。

洛古16

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1 T/ I8 Z5 z; W; \7 Z0 E; S! s* Q
! B' m1 @4 H3 d0 }; r2 I( x' z甲基纤维素的培养基只能用来检测造血干细胞，祖细胞的分化潜能么？- e5 N/ h4 i$ A& P' k
培养当中的二倍培养，三倍培养是什么意思呢？* \4 ?- m9 e) i: ?: {4 q
还望不吝赐教啊，谢谢

子非鱼

你现在是不是有一瓶甲基纤维素的培养基的体系啊？B cell的集落培养体系好像也是甲基纤维素的培养基，但是当时因为一些原因，我没有认真看产品的资料，所以也不确定。但是我们用的甲基纤维素的培养体系中有长出过间充质干细胞，但是不是聚集状的，所以间充质干细胞的集落应该是不行的。  ^2 N6 L3 Y3 A% ?. y
你说的二倍培养，三倍培养是集落培养中的吗？我没有听过，只知道原代集落的二次铺板。
3 t: J4 V$ Y, w  U" o+ c' @我是个渣渣，所以很多了解的都不全面。

jjjddf

我们分装一般是十五毫升，但是要看你的使用量来算

洛古16

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( n: K9 j! j  Z
有，STEMCELL的含有因子，木有EPO的培养基。* S, S9 Y( L, K- _
那，原代集落的二次铺板是怎么操作法呀？. b- s9 U7 t+ @; ]$ m) h
刚涉及成集落培养，看那个说明书好多都不认识。

子非鱼

我主要也是做的造血干细胞的集落。" q: s& _* q, ]! p% u: i
我贴一下我在书上看到的集落重铺的内容，因为书上是讲自己配集落体系的情况，所以你斟酌着看吧。3 `& N- h$ L6 o3 \1 V% t6 o
集落重铺  k6 x+ I; H9 s2 G6 Y  @: e; q9 E7 v
    注意：该技术只适用于使用甲基纤维素培养的原代细胞。琼脂培养基过于坚硬，极其难将其中的集落挑出进行二次铺板培养。若要将CFU-GM的原代集落进行二次铺板培养，只需将琼脂替换为甲基纤维素，并将2×McCoys替换为IMDM。' W7 X9 T+ G& [9 f  c7 v
材料/试剂
1 c9 f4 k. D5 q除非特别说明，所有材料均需灭菌
6 E* ^' @# N5 |(1)        带通风设备的超净台
0 w4 x) ?' g0 y. @8 X% p(2)        倒置显微镜+ ?" q7 {  h5 o  Q# _( o7 x
(3)        20ul微量移液器- q4 p: \$ D! c' m7 y: n+ f8 M+ G
(4)        含青霉素/链霉素的IMDM' @2 I/ g0 u% W5 Z/ h* r8 E& W) X7 S
(5)        12mm×75mm聚丙烯试管
' R% b$ x1 a  ~9 C, y: v0 M2 W$ M7 U收集集落步骤
. I( Q% v9 u4 p9 N* N  a7 s: ~所有步骤均需无菌操作。
; o8 p, C# n7 f1 o6 h: S+ V2 m, o(1)        确定需要进行二次培养的集落数目。每个集落准备一只试管，加入100ul含有2%FBS的IMDM，拧紧盖子。
  o( S$ @9 K; ]# L" u! N(2)        将显微镜放置在有通风设备的超净台中。
# R+ p# }1 k8 V6 T. v; R(3)        将含有待收集集落的平板置于显微镜的载物台上，固定平皿并移去平皿盖。
$ g8 d, ~) R0 ^* u# c: A1 d) s(4)        如果显微镜没有配置平皿固定装置，可将胶带的黏面向外环成一个圆圈，将两个这样的圆圈粘在载物台上，将平皿置于其上，同样能达到固定的目的。
6 w5 S7 z( s+ a: E6 ^(5)        找到目的集落后，用20ul移液器轻轻吸出集落。; c4 P) J, @, }% e% c1 w$ u" [
(6)        单独存在的集落最容易收集。
* M6 T. Z& H7 J" c4 H7 Y: V$ g(7)        将集落转移到（准备好的）含100ulIMDM培养基的试管中，吹吸数次以清洗吸头。
# N/ c4 _. m# E) u9 N4 @* Q(8)        集落收集完毕后，进行铺板操作。8 y7 |, Y+ Z4 R9 L: T8 ~  {
集落收集后的铺板步骤4 V; Q1 y$ I8 w, o, W
所有步骤均需无菌操作: I( e  F. c( b6 M' A+ Q0 j2 \
(1)        计算收集到的集落数，按每个集落1.1ml的量准备培养基混合液（包括甲基纤维素），静置使气泡溢出。% a! Y" n; x4 v% M' M6 G0 k
例如，如果你从含有IL-3、Epo和SCF等生长因子的平皿中收集了100个集落，那么就准备110ml培养液，所用生长因子与原始平皿中的相同，并在加入细胞之前加入甲基纤维素。2 i; ?! p' n* C) h4 G% O
(2)        当培养液澄清后，用配用16口径（gauge）针头的3～10ml注射器，向每个已含有收集到的集落的试管中加入1ml，振荡混匀。1 i% X  H  k% y( `* n; _
(3)        静置。" ^7 V; Y: q7 o8 ^. g7 [1 r
(4)        将上述混合液倒入新的35mm平皿中，转动使液体覆盖平皿。5 p& `' j: ?; C, D( W9 z
甲基纤维素比较黏稠，总会有培养液残留在试管中，因此不能100%重铺所有集落中的细胞。如果你的实验需要定量计算最后的结果，可以加入一定比例的培养基混合液，通过矫正计算进行统计。例如，加入1.1ml（1ml培养基+0.1ml收集的集落）培养基混合液中的0.9ml，所得的二代集落数则大致代表了全部集落中82%的集落生成细胞。/ b& q9 H% a6 r0 I
(5)将平皿放在37℃、5%CO2/O2的湿润环境中培养14d.7 h; w% N  V' Q: {7 P$ |5 n

洛古16

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" H7 r* g1 a* w0 L哈~~~非常感谢

洛古16

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. I: I% s$ P3 V9 X6 S/ u' Y; }
- m1 t3 \1 _' \! W. M9 c" P: F* `15ml啊，那用什么分装呀，注射器还是吸量管啊

jjjddf

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% R* V6 q9 r6 j; |+ X5 g/ _我们用的是吸量管