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我主要也是做的造血干细胞的集落。7 N' A8 ]3 P, h; A* I n
我贴一下我在书上看到的集落重铺的内容,因为书上是讲自己配集落体系的情况,所以你斟酌着看吧。
* o7 A( z5 t, y% n" u; {集落重铺7 }, d; O3 A% Q7 `4 U
注意:该技术只适用于使用甲基纤维素培养的原代细胞。琼脂培养基过于坚硬,极其难将其中的集落挑出进行二次铺板培养。若要将CFU-GM的原代集落进行二次铺板培养,只需将琼脂替换为甲基纤维素,并将2×McCoys替换为IMDM。
8 @- G0 O( `- P$ C; Y材料/试剂
- y% l8 k+ v6 ^9 I除非特别说明,所有材料均需灭菌
+ s1 n, }* i; N) V/ z(1) 带通风设备的超净台
w+ T1 y/ g: i" L(2) 倒置显微镜5 D$ f6 p( _4 |" o
(3) 20ul微量移液器( Q, i$ g3 Y. O& _- L
(4) 含青霉素/链霉素的IMDM
4 v- I- a: S) _3 X3 }& X7 J(5) 12mm×75mm聚丙烯试管
% W! h- M/ F- G- ]3 a- R收集集落步骤
+ h k( s; v* C M6 e( r. E p所有步骤均需无菌操作。
. X8 f, L6 K3 r, \% m; O* I(1) 确定需要进行二次培养的集落数目。每个集落准备一只试管,加入100ul含有2%FBS的IMDM,拧紧盖子。
+ {. ]% z7 z S(2) 将显微镜放置在有通风设备的超净台中。; {3 t, j( k+ G0 O; v" b U, i. {
(3) 将含有待收集集落的平板置于显微镜的载物台上,固定平皿并移去平皿盖。
. R O# L7 X5 |(4) 如果显微镜没有配置平皿固定装置,可将胶带的黏面向外环成一个圆圈,将两个这样的圆圈粘在载物台上,将平皿置于其上,同样能达到固定的目的。) o6 g% E; J9 t9 u- D
(5) 找到目的集落后,用20ul移液器轻轻吸出集落。
, f" z# s3 T8 q* f$ `(6) 单独存在的集落最容易收集。
2 N% l9 x& O6 U& g- M* l3 G3 E(7) 将集落转移到(准备好的)含100ulIMDM培养基的试管中,吹吸数次以清洗吸头。
5 d0 L& z# a% t# _/ r8 G2 I(8) 集落收集完毕后,进行铺板操作。1 M) u9 m7 D3 @2 o. j- O
集落收集后的铺板步骤. j9 t, L' I& q1 q. G
所有步骤均需无菌操作. G/ t2 V# X6 \. n- ^5 z
(1) 计算收集到的集落数,按每个集落1.1ml的量准备培养基混合液(包括甲基纤维素),静置使气泡溢出。
/ I% s; x+ e$ {+ }2 G4 h例如,如果你从含有IL-3、Epo和SCF等生长因子的平皿中收集了100个集落,那么就准备110ml培养液,所用生长因子与原始平皿中的相同,并在加入细胞之前加入甲基纤维素。) U- l' _8 L3 H: |2 e
(2) 当培养液澄清后,用配用16口径(gauge)针头的3~10ml注射器,向每个已含有收集到的集落的试管中加入1ml,振荡混匀。, j& O* ~1 ^8 [, w" ], e0 g' s
(3) 静置。
, a( T- P5 @+ j% W3 N( t6 E0 H3 L(4) 将上述混合液倒入新的35mm平皿中,转动使液体覆盖平皿。
7 f& I) _1 w. z0 q& L% C甲基纤维素比较黏稠,总会有培养液残留在试管中,因此不能100%重铺所有集落中的细胞。如果你的实验需要定量计算最后的结果,可以加入一定比例的培养基混合液,通过矫正计算进行统计。例如,加入1.1ml(1ml培养基+0.1ml收集的集落)培养基混合液中的0.9ml,所得的二代集落数则大致代表了全部集落中82%的集落生成细胞。; b+ f3 X1 x4 ? g# c
(5)将平皿放在37℃、5%CO2/O2的湿润环境中培养14d.7 L/ m3 F6 i" t) i
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