求指导NK细胞培养

yangpan521

哪位大神帮我看看这NK培养流程有没有不妥的地方，细胞数量上不去，着急啊2 Y2 D& g/ `5 Z. Q
培养材料：& q" G1 R7 K1 W; Y. h
无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆
$ M5 F5 o) D, `8 ~: w. ?1 L细胞因子：IL-2（1000IU/ml）、Anti-Human CD3（5ug/ml）、IL-12(500IU/ml）、IL-15(500IU/ml）& n0 a8 k6 z. N4 O
操作步骤：
3 E/ n4 c' ]0 l- G3 \" }0 X; n1、采血机采集外周成分血50ml ，用生理盐水1:1进行稀释，
: G- u- D; Z7 @/ ?% ?5 L& C2、由Ficoll液分离，去红细胞，收集初步纯化的单个核细胞：经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管，没管加入15mlFicoll分离液，将25ml单核细胞悬液，贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上，注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面，离心2000rpm/min，20min，升速1，降速0，离心后，液面分为四层，小心吸取第二层的单核细胞层，用无血清GT-T551洗涤2次，离心1800rpm/min，5min，20℃，弃去上清，再用5ml无血清培养液混悬。
* m# @9 }9 P- |/ {3、细胞计数：吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内，另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液，用血球计数板进计数。$ m2 S7 X% o. v$ ^6 E6 P& H* Y
4、将PBMC密度调整为2X106/ml，转入T75瓶中，培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15，并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。
/ I/ H; n! y5 X! c" Y2 N! y5、收集悬浮细胞：培养第10d观察NK细胞并收获NK：将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中，1800rpm,离心5min。去上清，用生理盐水再洗细胞2遍，最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中，转入细胞回输袋内，制成NK回输液。
, \" k" r2 |9 T( M

pppjjj

大约能扩增多少倍啊？

yangpan521

回复 pppjjj 的帖子4 R* u0 F( ~4 n) f/ N

4 @3 z! q4 ?2 B$ l90倍，有的低，都说可以扩大120倍，也不知哪出问题了

wind789

我看文献上类似方法有滋养细胞共育的。另外楼主你10天时,CD3-CD56+细胞的比例大概是多少呢？双阳的细胞大概是多少呢？

gondobar

楼主如果在成本允许的情况下，可以换更高级的培养基，90倍完全可以达到回输要求……

yangpan521

回复 wind789 的帖子9 H$ R4 D8 i( e" Z4 ]/ O1 M7 F
2 m& `: L4 e) I9 v# V6 [0 g* R/ s
20%左右

yangpan521

回复 gondobar 的帖子4 z; v8 e, r3 m( I4 u
# @! G! D: d/ A0 }& W8 r( C
请问我上面的培养不骤没什么问题吧

gondobar

回复 yangpan521 的帖子6 _3 H' ^$ A+ v) x) N. A& \: P

5 S; [! P( _, V* U8 Z5 G: a" M- T细胞分离过程和我们不一样，不知道你的方法能得到多少种子细胞。我们大约在5左右（七次方），如果你的方法更多，倒是可以学习一下。

wind789

yangpan521 发表于 2014-8-5 13:24
4 o1 D  ~  A' H3 E  W, q回复 wind789 的帖子# T! e! Q/ L* W/ m6 Z: p
2 t8 F9 i# y0 e6 G& L# J
20%左右

/ t! i  K& S" q2 j+ q2 T( N" e这种比例还算是NK吗？

单个核细胞

$ k0 k- o/ e# _7 I) w; q* F% v+ E! b
7 ~' R$ X+ w; ~' B( V' N
回复 yangpan521 的帖子* s7 I3 ?5 F# N. c+ l' ]  f) E

$ V) F6 }6 a( _/ J. v推荐阅读：. Q  N% ~8 D6 I  C( I& ?
2 u' E* {5 s1 T. J1 r# C1 w9 ^% U, K
Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells- z4 D1 i- O7 r& d+ P. v1 _8 _
http://www.jove.com/video/2540/e ... an-peripheral-blood
" h, g7 x0 W, C# I/ W$ b+ p* M
8 L& P' `! E$ [% S# }# O; W方案：
2 K7 y0 z0 m* p$ _( f8 A- g2 h2 a) x/ {3 s6 y
物料：