求指导NK细胞培养

yangpan521

哪位大神帮我看看这NK培养流程有没有不妥的地方，细胞数量上不去，着急啊/ m+ O' Q% L. y$ i% j  K
培养材料：
3 x: U% L$ f# h/ e无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆
; U( U  b5 z, K细胞因子：IL-2（1000IU/ml）、Anti-Human CD3（5ug/ml）、IL-12(500IU/ml）、IL-15(500IU/ml）5 I+ w- s0 @3 ?' T7 A
操作步骤：: d8 n& X% S1 U& r) \' x+ x, P; P7 `% G* k
1、采血机采集外周成分血50ml ，用生理盐水1:1进行稀释，
2 J; L5 A2 ?1 E; p2、由Ficoll液分离，去红细胞，收集初步纯化的单个核细胞：经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管，没管加入15mlFicoll分离液，将25ml单核细胞悬液，贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上，注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面，离心2000rpm/min，20min，升速1，降速0，离心后，液面分为四层，小心吸取第二层的单核细胞层，用无血清GT-T551洗涤2次，离心1800rpm/min，5min，20℃，弃去上清，再用5ml无血清培养液混悬。! G, C$ }: c1 _
3、细胞计数：吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内，另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液，用血球计数板进计数。
: z6 s( `5 y* [& R4、将PBMC密度调整为2X106/ml，转入T75瓶中，培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15，并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。# M3 ~7 Y+ L& s% x, [6 G
5、收集悬浮细胞：培养第10d观察NK细胞并收获NK：将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中，1800rpm,离心5min。去上清，用生理盐水再洗细胞2遍，最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中，转入细胞回输袋内，制成NK回输液。
, v% a% ^/ F* u; d4 l0 L$ ~

pppjjj

大约能扩增多少倍啊？

yangpan521

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# o3 b- I6 O9 @. |2 O! K' [/ b9 \+ K$ c
90倍，有的低，都说可以扩大120倍，也不知哪出问题了

wind789

我看文献上类似方法有滋养细胞共育的。另外楼主你10天时,CD3-CD56+细胞的比例大概是多少呢？双阳的细胞大概是多少呢？

gondobar

楼主如果在成本允许的情况下，可以换更高级的培养基，90倍完全可以达到回输要求……

yangpan521

回复 wind789 的帖子
* U7 I3 K! y! q+ B% \* r  b4 l# o$ n, v& N) q
20%左右

yangpan521

回复 gondobar 的帖子
0 H' |9 E1 X' a& z2 L! e
0 t, H. t: D! g& U9 H1 j请问我上面的培养不骤没什么问题吧

gondobar

回复 yangpan521 的帖子
6 x0 o0 g  H" x8 W1 O- ]: s/ w: `/ @. q% G  S; N
细胞分离过程和我们不一样，不知道你的方法能得到多少种子细胞。我们大约在5左右（七次方），如果你的方法更多，倒是可以学习一下。

wind789

yangpan521 发表于 2014-8-5 13:24
7 s* h' l& s* M4 ]. r3 ^+ g回复 wind789 的帖子
9 \" z/ p7 @# b* D6 s" p) {4 j! Z; i1 c' {5 z. r& B) C
20%左右

+ h' M& p! \' v8 i6 {这种比例还算是NK吗？

单个核细胞

8 C# H* p" `0 p' ~( S- G! ~6 u  D& d9 J( n$ D7 w. c
回复 yangpan521 的帖子. j( ?: S2 z% [
# f  ]* g  }9 `- h( B
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