核酸检测的一场革命，可替代PCR的犀利技术

pailishi

来源：生物通 2014-10-31 11:36
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自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。
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英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御、农业等领域。# u% B# z" P; Z8 u

/ I- [5 u% d7 R2 _RPA技术犀利在何处1 ~$ v$ ~( c& h. {+ v) h& I
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常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA反应的最适温度在37°C - 42°C之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。
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据介绍，RPA检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸（尤其是DNA）模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。
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RPA既可以扩增DNA也可以扩增RNA，还省去了额外的cDNA合成步骤。你不仅可以对扩增产物进行终点检测，还可以对扩增过程进行实时监控，甚至可以通过试纸条（侧流层析试纸条LFD）读取结果。
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目前，TwistAmp® 试剂盒的扩增子长度在500bp以内。不过，经过特别优化的RPA扩增，也可以生成更长的扩增产物，或者减慢扩增速度（便于定量），甚至在更低的温度下进行反应。* o0 p4 B* M, L+ d* ?1 _

/ m" E0 o5 [) j% _RPA技术的基本原理7 S1 t+ T7 I- D- e& }5 @
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RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37°C左右。
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ViaFect转染试剂9 ?, W0 L  ]7 b1 |" ]
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重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。
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RPA扩增的基础体系（TwistAmp® Basic）含有DNA扩增所需的所有试剂，我们只要准备好引物和模板就行。扩增结果可以通过凝胶电泳进行终点检测，产物纯化后可用于下游研究。2 F8 C( Q, a; O/ Q
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在这个基础体系中添入不同的酶和探针，就可以实现多样化的RPA应用。举例来说，TwistAmp® Basic RT添加了逆转录酶，可以对RNA模板进行一步法扩增。
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TwistAmp® exo结合了专利的exo探针技术和核酸外切酶III，能实现数据的实时读取，就像荧光定量PCR一样。不过反应终点的扩增子总量有所减少，适合获得强荧光信号进行动力学分析，不适合终点检测（比如跑胶）。将exo探针技术、核酸外切酶III和逆转录酶结合起来的TwistAmp® exo RT，可以一步实现RNA模板的实时扩增。
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TwistAmp® fpg是一个添加了核酶fpg的实时报告体系。fpg探针技术的荧光累积比较慢，但终点的扩增子产量不会减少，因此也能支持终点分析。TwistAmp® nfo加入了核酶nfo，可以用“三明治法”进行终点检测，比如测流层析试纸条LFD。9 K9 f7 t- _0 E! }3 G

1 T! }) e: k/ X# ]1 t除此之外，RPA扩增还可以很简单的实现多重化。只需要增加引物/探针就可以一次性检测多个扩增产物。
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4 N3 W. W$ l" e3 m5 BRPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。) j3 J6 L1 B- L3 I" ]6 J) z4 y: F. L

0 ]/ Z! F% L( O! F. W& W: N& o' ^在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，用户需要自己摸条件进行优化。虽然还没有设计软件可以使用，不过TwistDx Inc公司在自己的网站上提供了相应的筛选指南。+ B( y. {& T' j. i3 Y3 v

4 M4 u  f+ L6 h. O需要注意的是，目前的TwistAmp® 扩增试剂盒都没提供RNase抑制剂。另外，受目前的生产方法所限，RPA反应不适合用于E. coli标准实验室菌株的扩增。(生物谷Bioon.com)