石蜡切片之HE染色与免疫荧光

yeshch

本人近来石蜡切片一直做不好，出现以下问题不知为何或者没有找到解决方案，还望有经验的家友多多指点。问题如下：. b7 n5 k. H; X+ `9 o
1、材料由4%PFA固定，包埋之前自从脱水开始便皱缩，一直持续到浸蜡完成也未得到缓解。3 M, H  I7 X4 W; Z+ j8 E
2、HE染完色之后用清水冲洗时很容易褪色，基本染不上，不知为何，怎样调整染色时间和水洗时间都染不好；( }! A1 E- q, _& P, L
3、材料在操作过程中很容易脱离载玻片，使得材料表面不平整，容易残留液体。! y4 `7 ?: _1 r* n
4、免疫荧光封闭液用5%BSA取代影响大吗？一抗染的时间久一些没关系吧？显微镜下观察时材料总是不清晰，聚焦很模糊，感觉不在一个层面上（切得4um）

scarletkiki

切片后37过夜  好像经过处理后组织都有点缩 是不是你的染料有问题

ceshishua

楼主4μm的切片是啥组织？确实很薄啊。如果操作时稍有不温柔可能就会脱离玻片，可以考虑增加到8μm左右。至于封闭液还是根据二抗来选择一下相应的血清吧，保险！

yinchong42

回复 yeshch 的帖子. v' g) D; |5 U3 c8 y
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今天去医院参观，发现他们直接就是70度，20分钟左右就拿出来了，也不怎么掉片……

yeshch

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) l: n0 {, y, l3 U+ \  Q2 {0 s0 f1 C  h1 [0 B/ @8 D
下次试试，但是烤片实在有点不理解。thanks！

yinchong42

回复 yeshch 的帖子' Z) w) C/ n  g3 J# Y; `

# d  F- X6 U/ M; c) s我们烤片是比石蜡熔点高5度20分钟，然后37度过夜，再60度8分钟，37度12小时，60度5分钟，37度过夜，这样对抗原完整性会有帮助，而且不掉片；
; L3 e# Q$ K+ H5 B还有就是我们苏木素染色完从来不分色，直接就水洗然后用伊红，伊红之后不水洗，直接酒精洗。

moluxingke

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# w; p9 T8 C) m6 B- K2 n9 T* v不好意思，这个就不清楚了，可能和组织有关，也可能他们有“诀窍”，呵呵，我处理的组织经过这些程序后都会变小一点儿。

yeshch

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80度？！我们都是62度，或者37度过夜

yeshch

回复 moluxingke 的帖子: @4 g+ z- y0 `$ F! v
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受教了，可是别人说他们的组织脱水皱缩经过后面的步骤又变的坚挺了

limeiying

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通常室温封闭1h