大鼠及小鼠骨髓间充质干细胞的培养问题

本草亮星

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最近培养细胞时，遇到了一些问题，希望有经验的大侠指导一下！谢谢！！
3 ?; Z5 K% n4 I6 e4 |/ o一、大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）$ y1 L" e* [+ b
今年10月份开始培养SD大鼠BMSCs。2012年曾培养过SD大鼠BMSCs，全骨髓贴壁法，原代在7~10天可汇合90%，1:3传代后2~3天可汇合90%。现在原代培养了20天才汇合90%，1:3传代后7天才可汇合90%。所用器材试剂和方法与2012年相同。问题及照片如下。: `/ v: d4 ~$ o. X: W! k( u
培养基：DMEM/F12（含10%胎牛血清）! q* V1 d7 x  Q# u2 u  d0 U
说明：图1和图2中均是原代培养16天的的照片，图3（看上去细胞还可以）和图4中均是第一次传代培养7天的的照片。
4 }0 ]7 X3 @9 Q; M$ v问题：1.原代细胞培养时间过长是否细胞状态方面会变差？细胞生长缓慢的原因可能有哪些？+ Q0 F+ R  z# X5 J9 ]
2.图2和图4中黑色箭头所指的位置，看上去好像是一个椭圆形物质或结构内有3个到数个的小黑点，请问这是什么？
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图1 BMSCs,P0,16d,×40
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1 w: I+ n, L" y% T2 ?: ^3 n  `图2 BMSCs,P0,16d,×400
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图3 BMSCs,P1,7d,×40$ ~& ]) i- a  J( }

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7 ^' B& x2 y, ?$ V$ ]# Z图4 BMSCs,P1,7d,×400
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二、小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）
  G% Z/ Y  @/ u8 U% i另外，今年11月份开始尝试培养C57BL/6小鼠BMSCs。首先是根据大鼠BMSCs的培养经验，采用全骨髓贴壁法，所用器材试剂和方法与大鼠的相同。此外，尝试使用密度梯度法分离培养小鼠BMSCs，所用器材试剂与大鼠的相同。照片及问题如下。
+ E$ c$ w4 y/ m+ D: K* f" ?说明：图5、图6中采用全骨髓贴壁法，均是原代培养21天的的照片；图10，全骨髓贴壁法，原代培养26天的的照片；图7、图8和图9采用密度梯度法，分别是原代培养4天和8天的的照片。
. A, J2 H" w: e4 z/ X7 D: i$ M8 \问题：1.图5和图6，原代在21天仍未见成片连接的梭形细胞。图10中细胞形态比较均匀一致。一般来说，BMSCs应该为梭形，在汇合后细胞集落连接成片，但在图5中并未看到，若不是BMSCs，那又是什么细胞呢？图10中的细胞是什么细胞呢？" m( _1 ~, u' |# m6 c
2.图7，实验室有人说疑似支原体污染，请有经验者帮忙看看。
% q2 B" _( `! l- z0 B3.图8和图9，培养至8天，也未见明显的梭形细胞集落。图9中也可见小黑点，和大鼠细胞是一样的吗？
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图5 BMSCs,P0,21d,×40
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图6 BMSCs,P0,21d,×400& f$ N# w2 W  L( y( o
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图7 BMSCs,P0,4d,×200
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图8 BMSCs,P0,8d,×40
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5 a4 i) C: ?% i+ l6 }2 Y( u图9 BMSCs,P0,8d,×400
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图10 小鼠BMSCs,P0,26d,×40