诱导过程中挑选克隆的标准 与 iPSCs 的传代（有饲养层与无饲养层）

Andyhigh

最近在做重编程的相关工作，有几个问题一直困扰着我，想请教下！5 y) y# O9 i1 f( c8 y

, U0 H3 m2 D8 L$ A; t1 [* ]+ {1. 自己在试验当中，发现克隆的同步性不是很好，大家是如何确定最佳时间的？刚开始自己是发现有一些克隆就挑选，剩下的继续放入培养箱继续培养，这样的结果往往是克隆摊开（应该是分化），甚至个别孔出现污染（细胞漂浮）；( z# ^. ~0 N7 n' {5 r2 b
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2. 大家是根据什么标准样挑选克隆的？先分享下自己的经验（第一，克隆致密；第二，克隆边缘清晰；第三，克隆未老化；第四，克隆呈现圆形 椭圆形等形状；重要性按照排名先后）额；即使是这样，发现自己的AP阳性率（AP阳性克隆数/克隆数）也不高（10%-20%），且能支持单细胞传代的就更少了，比例差距比较大，有些是挑选几个就出现1个阳性的，有些是挑选30几个才出现一个；效率太低；$ l% p- s0 i* e1 O4 K

' T4 L( R& ^2 g+ l! ]7 _# |% \! |3. iPSCs 传代的问题，不知道大家用的是什么样的方法，是单细胞传代还是克隆传代？希望大家能回复下具体而详细的步骤！先提下自己的疑问：有多大比例的iPSCs 能支持单细胞传代，自己只了解06年 07年的iPSCs，单细胞传代能力还是一个不错的指标；
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. I. R* W* C) |4. 在病毒诱导出现克隆后，大家一般是怎么处理的？是手动的挑取克隆，还是用化学的方法进行消化传代····
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7 `8 ^. B* V2 P3 ?+ c, t6 @" d5. 无饲养层诱导和培养的iPSCs，大家是怎么进行传代的；最近，获得了一孔这样的iPSCs，本来打算扩大培养的，自己就用Tryple 消化的方法收集细胞，并吹打（30下）成单细胞悬液，以便均一的进行扩大培养，不过遗憾的是，细胞就这样无法形成单克隆了；自己推测的问题是，这样的iPSCs 无单细胞传代能力；自己查到了一篇文献，文献上说的比较模糊，只是说手动的挑选克隆进行传代！不知道大家用的是什么方法···
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补充内容 (2014-12-15 21:46):
1 v+ B& O+ Y1 ]0 v3 m3 P- r2 U* U我的QQ：945366086
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2 N8 A9 [+ |$ x' ^4 z" o) F9 U5 j  u补充内容 (2014-12-22 13:42):# d7 x* E9 K. b
不知道大家怎么消化克隆样的细胞的（主要指那些致密的克隆），自己发现按常规的方法：1个克隆加入300ul tryple 轻轻吹打20-30下，感觉消化不下来（消化下来的细胞很少），也不知道是什么原因，基本排除试剂的原因

jojo1988509

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. _1 I2 K# e( s* {' N不好意思，这久太忙了，LIFE的，41-1000，41-1100，41-4000分别是TRA1-60，TRA1-81和SSEA4的

陈阳阳

1：手动挑取形态比较好的克隆，条件：呈明显突起，致密，消化后传到无feeder的96孔板，用ES+2I培基，然后接着传代至48，24，12，6孔板，最后挑状态好的进行冻存和下一步的实验。  c0 K3 y6 b1 z$ l
2：iPSCs 传代的问题，不知道大家用的是什么样的方法，是单细胞传代还是克隆传代？   
% P+ c  N( I2 L5 N9 W     直接用胰酶消化传代即可。1 L/ y0 ~8 W0 ?% Q- J
3：自己在试验当中，发现克隆的同步性不是很好，大家是如何确定最佳时间的？
6 `% H1 K% m, N# V1 {( D     克隆的同步性本身就不是一致的，所以不用担心这个。只要有出现形态好的克隆，就可以挑。挑几十株，最后肯定就可以建系的。也可以出现前面的克隆已经建系了，还有的克隆才传到12孔板还没长起来。
  O0 ]! B' o; D2 H甚至个别孔出现污染（细胞漂浮）；  这应该也是正常情况，你没挑，克隆肯定会分化啊。细胞漂浮，可能是正常的细胞死亡。

mecol

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+ a* V* G* N7 X. U6 A6 R好的，谢谢

Andyhigh

回复 jojo1988509 的帖子* C3 J) m& D  E1 q$ F4 [+ F% W. `3 e7 u

; p" l% O4 t6 y( ^: B- g* m可有相应的货号哈？

Andyhigh

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9 c6 A; _2 E: _- `$ `" p细胞经 固定 透膜后都死了，所以是不照的！

mecol

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# s% X4 }2 W9 s请教一下，AP染色后的细胞还可以接着培养并传代吗？

jojo1988509

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Life直接就有卖的活染的TRA1-60、TRA1-81、SSEA4，直接有详细步骤的。

Andyhigh

回复 jojo1988509 的帖子) M( z6 F1 }6 Y5 q9 T1 G  o
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也就多挑一些质量好的克隆了，能具体说下活染嘛？

Andyhigh

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