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最近在做重编程的相关工作，有几个问题一直困扰着我，想请教下！* L0 f8 t9 d2 {' T7 z# X
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1. 自己在试验当中，发现克隆的同步性不是很好，大家是如何确定最佳时间的？刚开始自己是发现有一些克隆就挑选，剩下的继续放入培养箱继续培养，这样的结果往往是克隆摊开（应该是分化），甚至个别孔出现污染（细胞漂浮）；
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2 z: F. v- i1 m- ^2. 大家是根据什么标准样挑选克隆的？先分享下自己的经验（第一，克隆致密；第二，克隆边缘清晰；第三，克隆未老化；第四，克隆呈现圆形 椭圆形等形状；重要性按照排名先后）额；即使是这样，发现自己的AP阳性率（AP阳性克隆数/克隆数）也不高（10%-20%），且能支持单细胞传代的就更少了，比例差距比较大，有些是挑选几个就出现1个阳性的，有些是挑选30几个才出现一个；效率太低；
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- r6 E7 I! r* }& a9 X3 h8 o( b3. iPSCs 传代的问题，不知道大家用的是什么样的方法，是单细胞传代还是克隆传代？希望大家能回复下具体而详细的步骤！先提下自己的疑问：有多大比例的iPSCs 能支持单细胞传代，自己只了解06年 07年的iPSCs，单细胞传代能力还是一个不错的指标；# g$ K3 }! e9 s& N9 `5 Q. E
1 h* j' d. H6 z- d% Y% k4. 在病毒诱导出现克隆后，大家一般是怎么处理的？是手动的挑取克隆，还是用化学的方法进行消化传代····; }: o3 W/ O, q. W
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5. 无饲养层诱导和培养的iPSCs，大家是怎么进行传代的；最近，获得了一孔这样的iPSCs，本来打算扩大培养的，自己就用Tryple 消化的方法收集细胞，并吹打（30下）成单细胞悬液，以便均一的进行扩大培养，不过遗憾的是，细胞就这样无法形成单克隆了；自己推测的问题是，这样的iPSCs 无单细胞传代能力；自己查到了一篇文献，文献上说的比较模糊，只是说手动的挑选克隆进行传代！不知道大家用的是什么方法···. i4 }. h5 `, e8 W: k
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补充内容 (2014-12-15 21:46):- X f) A4 A/ d9 ^5 d/ J
我的QQ：945366086
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补充内容 (2014-12-22 13:42):4 y* G% J8 E! J/ x6 j4 t
不知道大家怎么消化克隆样的细胞的（主要指那些致密的克隆），自己发现按常规的方法：1个克隆加入300ul tryple 轻轻吹打20-30下，感觉消化不下来（消化下来的细胞很少），也不知道是什么原因，基本排除试剂的原因 |
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发表于 2014-12-5 10:05
发表于 2014-12-6 15:53
