诱导过程中挑选克隆的标准 与 iPSCs 的传代（有饲养层与无饲养层）

Andyhigh

最近在做重编程的相关工作，有几个问题一直困扰着我，想请教下！
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" `  R: d& A  \4 [2 P# P# `1. 自己在试验当中，发现克隆的同步性不是很好，大家是如何确定最佳时间的？刚开始自己是发现有一些克隆就挑选，剩下的继续放入培养箱继续培养，这样的结果往往是克隆摊开（应该是分化），甚至个别孔出现污染（细胞漂浮）；
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' Z. P+ o% V+ a' k- h; X# I0 O6 @2. 大家是根据什么标准样挑选克隆的？先分享下自己的经验（第一，克隆致密；第二，克隆边缘清晰；第三，克隆未老化；第四，克隆呈现圆形 椭圆形等形状；重要性按照排名先后）额；即使是这样，发现自己的AP阳性率（AP阳性克隆数/克隆数）也不高（10%-20%），且能支持单细胞传代的就更少了，比例差距比较大，有些是挑选几个就出现1个阳性的，有些是挑选30几个才出现一个；效率太低；
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3. iPSCs 传代的问题，不知道大家用的是什么样的方法，是单细胞传代还是克隆传代？希望大家能回复下具体而详细的步骤！先提下自己的疑问：有多大比例的iPSCs 能支持单细胞传代，自己只了解06年 07年的iPSCs，单细胞传代能力还是一个不错的指标；, u0 Y. N6 h* R% s
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4. 在病毒诱导出现克隆后，大家一般是怎么处理的？是手动的挑取克隆，还是用化学的方法进行消化传代····
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! X0 O7 F8 i& {5 j+ T' K& }4 D( x4 O5. 无饲养层诱导和培养的iPSCs，大家是怎么进行传代的；最近，获得了一孔这样的iPSCs，本来打算扩大培养的，自己就用Tryple 消化的方法收集细胞，并吹打（30下）成单细胞悬液，以便均一的进行扩大培养，不过遗憾的是，细胞就这样无法形成单克隆了；自己推测的问题是，这样的iPSCs 无单细胞传代能力；自己查到了一篇文献，文献上说的比较模糊，只是说手动的挑选克隆进行传代！不知道大家用的是什么方法···
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8 _0 b5 Z( c3 u: K- _补充内容 (2014-12-15 21:46):% d$ t1 w8 f: g0 L6 H1 K4 F7 U6 @
我的QQ：945366086
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补充内容 (2014-12-22 13:42):
( j$ {8 g" Y% X1 |9 T4 m: {6 J2 _不知道大家怎么消化克隆样的细胞的（主要指那些致密的克隆），自己发现按常规的方法：1个克隆加入300ul tryple 轻轻吹打20-30下，感觉消化不下来（消化下来的细胞很少），也不知道是什么原因，基本排除试剂的原因

jojo1988509

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. V7 c3 B, E. Q3 `不好意思，这久太忙了，LIFE的，41-1000，41-1100，41-4000分别是TRA1-60，TRA1-81和SSEA4的

陈阳阳

1：手动挑取形态比较好的克隆，条件：呈明显突起，致密，消化后传到无feeder的96孔板，用ES+2I培基，然后接着传代至48，24，12，6孔板，最后挑状态好的进行冻存和下一步的实验。
+ B7 L* y9 A$ a1 j0 V* \% @3 \2：iPSCs 传代的问题，不知道大家用的是什么样的方法，是单细胞传代还是克隆传代？     G9 V8 t+ a' u) }; y; H8 j" ?
     直接用胰酶消化传代即可。# {1 i  N) M9 @  ?
3：自己在试验当中，发现克隆的同步性不是很好，大家是如何确定最佳时间的？
) k) P& E5 @* ?. o% H$ O     克隆的同步性本身就不是一致的，所以不用担心这个。只要有出现形态好的克隆，就可以挑。挑几十株，最后肯定就可以建系的。也可以出现前面的克隆已经建系了，还有的克隆才传到12孔板还没长起来。
$ B' v& |& D) t# e甚至个别孔出现污染（细胞漂浮）；  这应该也是正常情况，你没挑，克隆肯定会分化啊。细胞漂浮，可能是正常的细胞死亡。

mecol

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好的，谢谢

Andyhigh

回复 jojo1988509 的帖子; z0 Y+ L% e: P% L! x2 W" Y! X0 E/ P

% U" v, g2 |9 z9 a' v4 e2 m可有相应的货号哈？

Andyhigh

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细胞经 固定 透膜后都死了，所以是不照的！

mecol

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) k  _9 k0 z  P+ V1 B8 S请教一下，AP染色后的细胞还可以接着培养并传代吗？

jojo1988509

回复 Andyhigh 的帖子0 D1 @  {+ D5 B+ d# w
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Life直接就有卖的活染的TRA1-60、TRA1-81、SSEA4，直接有详细步骤的。

Andyhigh

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: k3 Y! D  X6 ^; Z# u  S也就多挑一些质量好的克隆了，能具体说下活染嘛？

Andyhigh

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欢迎多交流！