MSC成脂诱导培养步骤和鉴定

sunny

(一)、MSC成脂诱导培养步骤
6 A! J! v1 {; W- o) W2 O1 HMSC生长培养基：α-MEM，20%FBS
4 V- m3 D8 i& |) |3 g1 U/ ~MSC成脂肪诱导培养基为：Low-glucose DMEM，10%FBS ，10-6M地塞米松，0.5mM IBMX，60μM吲哚美辛（Brumo 2004）6 a5 s# Z  |3 ~$ s/ T* K
1、使用胰酶消化体外扩增培养至第3代的MSC（消化方法参考MSC分离培养）
1 \% I2 F6 X( t7 Q) J/ h5 f# w（1）弃培养液，用复温的D-Hank’s 液洗细胞2次；
/ W2 `9 v  O& M( {（2）吸干Hank’s液后，加入1ml 0.25% trypsin-EDTA消化细胞；
4 d+ X( `: B5 S, j（3）于倒置显微镜下观察细胞消化的情况，若细胞胞质回缩，细胞间歇增大，须立即加入少量培养液终止消化；
7 U& m8 }9 `- @5 B（4）然后用吸管吸取培养瓶中的培养液反复吹打瓶壁制备细胞悬液，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。
( j& G; ]( M' v) F1 G, f: N) e1 F（5）离心，350g×5 min，弃上清，用复温的D-Hank’s 液洗细胞2次。根据细胞数，加入适量α-MEM培养基，制成细胞悬液。& I0 N$ u5 \  v5 G- k
（6）细胞计数。: [9 a% h1 i9 C# {, }
2、按20,000-30,000 cells/cm2接种细胞于预先放置有消毒处理好的盖玻片的6孔板内，加入MSC生长培养基，培养24-48h，细胞达到完全融合（high confluency of the cell layers is an important step for good adipogenic differentiation. （Brumo 2004））
! d4 k3 _. d7 ?3、细胞完全融合后，换用诱导培养基培养  E1 ]5 Y: X- G
4、每2天换液一次，培养至14d。
' a/ ]) Y$ j* H; c(二)、MSC成脂诱导鉴定. N8 E6 f/ c8 ?3 U
1、取诱导14天的MSC细胞爬片， PBS洗涤3次。9 f( c! G1 z- I9 d1 \( Q
2、10%甲醇固定20min。9 H: i4 T0 t3 W+ o$ [& r2 e
3、PBS洗涤2次，加入2%油红O染料染色，室温15min。) `& Y$ l5 B& D3 m  [; I
4、弃去染液。70%乙醇漂洗后，用水冲洗。1 `; z* X8 u) ~6 r
5、苏木精复染1min。（注意不能深染）- l7 @4 b, r1 R/ W$ P
6、烘干后二甲苯透明20min，中性树脂封片。
4 i5 t3 Y; Y1 `6 a% L8 G5 e7、油镜下观察脂肪细胞染色情况。（细胞核呈兰色，脂滴成橙红色）

一直

非常感谢

woaiwangy1

请问苏木素复染就是直接加上苏木素就可以了？然后一分钟后洗去观察？是不是也可以不复染啊？

deshenglll

谢谢楼主啊

mojai

谢谢，学习了！

wenty

应该不能不复染吧，不然细胞核是无色的。另外，诱导分化时只换液，不传代吧

meng19821013

ding qi