MSC成脂诱导培养步骤和鉴定

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(一)、MSC成脂诱导培养步骤, |/ r8 E0 z; ^/ s/ O* R7 `* k( p
MSC生长培养基：α-MEM，20%FBS# W- y2 ~; F. l+ A; Y# L! t
MSC成脂肪诱导培养基为：Low-glucose DMEM，10%FBS ，10-6M地塞米松，0.5mM IBMX，60μM吲哚美辛（Brumo 2004）' e4 l  n& L; a- L
1、使用胰酶消化体外扩增培养至第3代的MSC（消化方法参考MSC分离培养）. i/ P3 b; N6 g5 I: O
（1）弃培养液，用复温的D-Hank’s 液洗细胞2次；
2 O' @  v& F4 E- b1 ?（2）吸干Hank’s液后，加入1ml 0.25% trypsin-EDTA消化细胞；- G2 x- B# `8 |( a7 ~& _% ]5 S/ p
（3）于倒置显微镜下观察细胞消化的情况，若细胞胞质回缩，细胞间歇增大，须立即加入少量培养液终止消化；
; ?- ~1 Y! _+ q$ S! r% ^（4）然后用吸管吸取培养瓶中的培养液反复吹打瓶壁制备细胞悬液，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。# ~1 `2 {+ b% R' W1 |: w% J
（5）离心，350g×5 min，弃上清，用复温的D-Hank’s 液洗细胞2次。根据细胞数，加入适量α-MEM培养基，制成细胞悬液。5 M  r; Y/ f8 w( d4 F
（6）细胞计数。$ O) c% y- `8 J& m2 q+ u* u
2、按20,000-30,000 cells/cm2接种细胞于预先放置有消毒处理好的盖玻片的6孔板内，加入MSC生长培养基，培养24-48h，细胞达到完全融合（high confluency of the cell layers is an important step for good adipogenic differentiation. （Brumo 2004））
# P7 O6 B  ^5 |, A- h3、细胞完全融合后，换用诱导培养基培养9 K  D1 m7 _) {9 J" n+ C% q
4、每2天换液一次，培养至14d。5 ^  y7 g* x' u4 b0 M; m
(二)、MSC成脂诱导鉴定0 B/ C# }- B7 O- B$ j
1、取诱导14天的MSC细胞爬片， PBS洗涤3次。! o; d( C2 i% _
2、10%甲醇固定20min。
! G! u9 ~) @: Y5 s. P% M. Z4 |9 I; u3、PBS洗涤2次，加入2%油红O染料染色，室温15min。" a/ w9 j* g* T7 B, e
4、弃去染液。70%乙醇漂洗后，用水冲洗。6 ~( \/ g  S: ^5 v* f
5、苏木精复染1min。（注意不能深染）, J" L  ]7 T) v
6、烘干后二甲苯透明20min，中性树脂封片。
: L/ k5 i$ x8 K% f7、油镜下观察脂肪细胞染色情况。（细胞核呈兰色，脂滴成橙红色）