细胞复苏失败原因？

lvyananwyb

前两天复苏细胞，完全没长，并且没有污染，是什么原因呢？是不是由于复苏动作慢，DMSO对细胞损伤太大而死亡的？请各位给分析一下，谢谢

yuanyecat

复苏要素
2 O( y6 n+ y! u第一，dmso必须洗干净，推荐用medium洗两次，
9 C) G5 r, A  x7 F( P& z第二，种密度适中，推荐100000-500000个每毫升

a2782953

回复 张钰0206 的帖子8 I, F$ E! A) C

7 q) z9 y$ B+ {9 q, ^/ L我想问下，冰浴的生理盐水会减少细胞损伤的原理是什么呢？谢谢！

zhrt

回复 lvyananwyb 的帖子
& X2 b, q% a( q4 |6 V1 P  D3 u
9 P7 @; b5 u: ^0 Q' G) ]4 m) s  q1.接种密度过低0 y8 u2 u, C% H* b+ [3 I
2.细胞活性太低（1.酶消过长2.本身细胞状态不好）" g2 }/ |; P( B7 t) G
3.DMSO的浓度及添加时机

帝国黑骑士

楼上的前辈们说的都有道理并且比较全面了，细胞完全没有长，这个很奇怪，操作上的一些问题不会导致完全不长，所以我觉得最大的问题可能出在DMSO上，要么是冻存时出问题，要么是复苏时冻存液清洗不彻底，残留的冻存液对细胞生长有很大影响。建议再重做一组冻存复苏的实验，排查下原因。

woshibotao_01

觉得应该先想想冻存前冻存方法是否合理。如果合理，再找复苏的原因。
2 b4 s; u% L  Y, t& B* d  `0 J复苏时水温在38度，将冻存管快速投进水中，并摇晃冻存管，使冷冻细胞悬液在一分钟之内融化，然后立即取出。8 D. u) f! U* b* D# D
将细胞洗涤，目的是把DMSO洗掉，离心力不要太高。8 p, r1 k* J" L) E' P
最后用平衡至室温的培养基培养。
; N1 u4 R2 P! R9 B2 z" P1 U# H* N" N" N- l5 ~) D

chenlin080102

最佳的复苏过程应该是尽量缩短水浴锅溶解的时间，然后加入到预温好的培养基中，培养基体积至少是冻存细胞体积的9倍，也就是说要做10倍稀释；还有就是不建议刚复苏的细胞就离心，因为此时细胞很脆弱，建议第二天再离心换液。

cloudycity

我觉得是冻存前细胞就不行了，或者冻存的条件不行。你是在什么条件冻存的？冻存条件不是稳定超低温，就很伤了。+ Y& d( D0 t3 R$ G* b
+ W" t6 ~' D; O( g6 F0 M
复苏的话尽量快，我都是用40℃复苏的。你用的冻存也dmso比例是多少？我曾经试过msc在5%的dmso  37℃复苏后放置常温30min，活率都有6-7成。

colins

我觉得如果经常做的话不至于因为复苏动作慢就导致细胞完全不长，完全没长的话就不单应该从操作上找问题，可以试着从细胞本身找原因，是不是在冻存时出问题了？如果是在学校的话，有没有可能你们的冰箱断过电啊，这些都有可能，我就遇到过。至于污染问题，我觉得最好自己真正检测一下，尤其是支援太，肉眼看不到的

lvyananwyb

谢谢各位的分析，细胞是别人冻存的间充质干细胞，以后复苏时会注意操作速度，以及复温时间的控制。