CIK细胞的制备方法 - 免疫细胞治疗专区干细胞之家



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发表于 2015-3-3 19:37 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

【背景】CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。  CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g,  IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，  其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。

【培养原理】( |9 z5 g* i3 \4 }# W/ D* e
CIK培养用细胞因子和抗体：* \6 J; B8 g0 S9 a; q1 N% }8 B
n# s- u3 j: N7 c
CD3激发型单抗：
T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor,  TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck,  Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based  activation motif,  ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。! f- E4 Y( f. L& P
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由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。
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此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。
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IL-2 (白细胞介素-2)
  IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor,  TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。

n* K  R- s" H  {- t! v5 W
IFN-g (干扰素-g)
  IFN-g  具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-  g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN-  g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。
% X* d( s/ L% ^( G4 n/ F1 I6 Z
n2 f/ o3 m2 z, b9 Y) h
IL-1a(白细胞介素-1a)
  IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK  的细胞毒作用。
  R# s3 s4 m/ h1 H( f( R
【细胞制备】3 o% N" @" c" Q/ l
1．( m0 R$ n" Q3 ]! D
外周血单个核细胞的采集
1.1
用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；
1.2* K( Q/ w- P' p. ^8 q2 H: B+ H7 z
淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；% p. j0 z+ O- V3 W$ M( C3 e
1.3, }  G6 Q- c. ^) L
无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。8 Y0 j( n! C! E  ?; x

2．' [: _' D+ J! |7 ?, s
CIK细胞的培养及鉴定
2.1
将PBMC按1-2 x  106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g，37oC，5%CO2培养箱中培养；
2.2
24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml  的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；5 P& l* k1 w" `4 {. u8 C
  注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。
2.34 v% g" h# s1 m) ~
每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；7 d) c, e5 g! X' c$ }  G1 \
2.4
在培养的第14d，收获CIK细胞。: a5 d  F! H7 y- A. L( ~& D8 F
2.5
CIK细胞质控：
2.9.16 r8 \; y, e4 n* ^+ h+ f$ I
台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；9 G3 [' }) a! f" W' j+ g  G1 A, p1 t
2.9.2) U# |; X, U4 H& V3 Y. o
流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。
2.9.37 b. ]! _1 b, r' V7 O
细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10  : 1(数目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200  ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。. {1 G8 E0 D+ e
2.9.4
收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素<5  Eu)。" e+ L% t/ w9 @/ l  Z0 R
3 C3 d  m7 T# H# n: F: V
【步骤简图】

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