CIK细胞的制备方法 - 免疫细胞治疗专区干细胞之家



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发表于 2015-3-3 19:37 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

【背景】CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。  CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g,  IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，  其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。1 x# X9 j6 K$ P! M
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【培养原理】7 |: u2 W9 H8 H8 a2 H
CIK培养用细胞因子和抗体：
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CD3激发型单抗：! t# G) T/ ^! N! e0 a% p' I
T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor,  TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck,  Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based  activation motif,  ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。

由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。3 w$ H& L" x8 s& e- w7 r
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此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。

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IL-2 (白细胞介素-2)
  IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor,  TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。
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IFN-g (干扰素-g)
  IFN-g  具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-  g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN-  g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。

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IL-1a(白细胞介素-1a)& I3 A; |) R7 y  [# O5 f! q( ]- m
  IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK  的细胞毒作用。8 T. j( b6 R! Y+ t+ f2 S# T
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【细胞制备】- _# _8 D; d. S( \' }
1．
外周血单个核细胞的采集
1.18 K9 g1 `+ P; {$ Q& L
用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；2 o) J0 K- z8 T6 Z4 X6 r
1.26 D" S  e$ ^+ ^; Y6 _
淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；
1.3
无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。( r. N+ d# h9 W9 P2 n

2．* g9 W. _$ H$ y
CIK细胞的培养及鉴定
2.1
将PBMC按1-2 x  106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g，37oC，5%CO2培养箱中培养；
2.23 B0 o9 d2 o+ Y/ v  A. B
24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml  的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；
  注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。, \7 X- p( {8 x; B, d2 L5 T' |4 k
2.3( p1 X6 M- h7 @& ~' H/ J8 S3 n- }
每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；: @, R7 d0 O( N# c
2.4! x3 u2 _- p4 M( `6 Q1 o
在培养的第14d，收获CIK细胞。# `# N1 C$ v* i+ W& n
2.5
CIK细胞质控：3 i1 s" C5 I& e! S1 Y
2.9.1
台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
2.9.2( X/ ^' x7 p4 Y  c# J
流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。
2.9.3
细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10  : 1(数目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200  ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。' ?5 k6 g; r% e
2.9.4) W$ z4 T9 M6 c) f
收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素<5  Eu)。

【步骤简图】0 ^* d/ [8 Z- a2 B0 I

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