分离单核细胞时，如何吸取白膜层？

zz091115

15ml离心管比50ml的效果好 可能是液体张力的原因吧 还有个就是你离心结束一定要慢慢减速 不要迅速从400g降到0 这个非常重要

cloudycity

你具体的操作是怎样的？* Z  j9 ?, g( d* b4 Z) s. x3 W5 z$ h+ X
血液如何稀释？在ficoll上铺血铺地好不好？血和ficoll的界面有没有被弄乱咯？如果都做好了还不明显。那就是太稀/血不行····: H9 J  h0 E* N" h9 m( ?

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cloudycity

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: x" h) u/ P8 e, m) y9 c3 u' ]' J* N, C1 e0 k( C8 f* J
没什么必要···个人觉得，只是追求技术上的完美···哈哈

维维睡啦

你用的多少毫升的离心管？先把最上层吸出来弃掉，再吸中层，白膜层以下、红细胞层以上的这一层要保持在0.5公分左右即可，这样可以尽量减少细胞损失，也不容易引入其他杂细胞，效果很好。

fenlichong

白膜层一般规范操作应该能观察到明显分层。操作时注意：1、待分离液恢复到室温后，将其从离心管底部加入，禁止沿管壁加入；2、将稀释后的血液沿离心管管壁缓慢加入，铺层要缓慢细心，控制血液流速以免流速太大而冲击铺层界面；3、盖好配平离心，全程动作务必小心，防止液面混合；4、离心完后，可见分层。用5ml移液管小心吸取白膜层，可边轻转离心管边吸，尽量吸干净。另：使用分离管分离白膜层效果较好，可试试。

lxy07

回复 维维睡啦 的帖子8 j! V- x$ ?8 l4 x' H6 x; |, `

% W0 G  }% l: k# L4 z' [1、Ficoll是MNC专用，密度是1.077。
% R8 [4 y2 k/ ~2、去血浆，稀释了。
! e. a  o4 X: d- R- i3、FICOLL和血细胞有明显分层。: F$ z3 B7 |2 V$ Y: \/ d* u5 v+ }
4、升降速调低了。
1 C; \+ c- R1 a7 x5、离心后有明显的三层，如果将中间层的液体全部吸出来，会使混的红细胞和血小板等杂细胞较多，有的人主张白膜层以下、红细胞层以上的这一层要保持在1公分以上，是否有必要。

维维睡啦

1、先检查一下你们的FICOLL是否为MNC专用，其密度是否符合标准,为1.077±0.001。
. @9 v6 J& ], ?, L( D2、全血加FICOLL之前要去血浆，稀释的。. A3 M: q  i1 C0 A$ H7 X
3、加FICOLL时要小心仔细，使FICOLL和血细胞有明显分层。/ r. C6 S- j! z8 g% D  M
4、FICOLL离心时，升降速都要调低，一般为升6降4就可以。
% U+ B; H6 D0 U0 F; b5 {) t5、离心后即使没有明显白膜层，也会有明显的三个分层，上层为生理盐水和血浆混合，中层FICOLL层，下层血细胞。白膜层就在中层FICOLL层中，即使没有明显分层，绝大多数单个核细胞也是在这一层中，如果没有明显分层，可以把这一层液体全部吸出来，再离心获取单个核细胞。! \5 b" B2 W# [$ D1 y1 w* R

lxy07

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, z: L" g5 l. W9 `* t
你是说血加上去以后吗？刚铺好不久后，就像cloudycity说的，血自然沉降像细雪一样降下来，但没有看到分层啊。

lxy07

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1、是人的，Ficoll也是分离人的。3 m3 S8 K, c  m8 q+ c* N: M% [; e
2、我们用的也是TBD的，降速已经调低了。# \0 ~4 @7 p% q. K& h
3、脐血，75ml，血样算新鲜的，没有凝块。
- J8 s6 u/ O' Y& `; {$ l4、我看有的帖子上说，取白膜层的时候要蹲着平视离心管操作，这样做是不是能更好的吸到白膜层。

wanglinling

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那你应该观察一下刚铺好梯度的时候分层是否明显，可以看出你铺的好不好