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- 积分
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- 威望
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- 包包
- 9
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成骨诱导培养: 取第 3代细胞, 接种入含体积分数为 4 W+ t k/ R( B9 N) f+ g- d
0.1 的新生牛血清 、4 A! o$ z& C# @
0.1 μmol/L 地 塞 米 松 、
* G' ~. y' h% r1 Y+ w50 μmol/L 抗 坏 血酸 、% {/ s( z8 |5 ?
10 mmol/L β- 甘 油 磷 酸 钠
7 B' a. _$ R9 @1 ~( f% C的 高 糖 DMEM培养基进行成骨诱导培养, 进行形态观察、功能检测。间充质干细胞成骨特性检测: ( ~6 ^8 M9 c/ @9 y2 m
①碱性磷酸酶组织化学染色: ) Y+ N6 p$ S0 s
取成骨诱导 14 d 的细 胞 , 40 g/L 中 性 甲 醛 固 定 15 min, Gomori改良钙钴法染色。取 5 块玻片, 每片随机取 2个视野, 采用网格计数法, 计算碱性磷酸酶染色 阳性细胞的百分比。. V# q/ e' F8 }4 [( F8 l5 f8 P
②碱性磷酸酶活性检测:
9 x6 M) x$ x9 r$ z取第 3 代细胞, 以 1×105/ 孔的密度接种于6 孔板中, 分别成骨诱导 3, 5, 7, 10, 12, 14 d,按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。4 H; Q. c2 O" ~: H1 z5 ?3 q7 {% j
③钙结节染色: 2 P/ `& s$ I1 U+ _
Von Kossa’s矿化结节染色法 9 ]3 U ~, T% G$ G r, R
原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。
* Q# n. ]+ q% _! JVan kossa银染色法
7 X( q7 D& Q! X8 G& _, ?, A$ r试剂： I- u+ o& V8 i
1．2%硝酸银水溶液：硝酸银2g蒸馏水加至100 ml。& ?. e6 h5 m0 E. J; T$ e. d
2．5%硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠5g，蒸馏水加至100 ml。9 S6 s' S1 z0 f. J
" ]3 b' o- {" a1 s: S培养皿用PBS冲2次，95%乙醇固定10分钟，蒸馏水冲洗3次
& o9 N" p. L# p0 t) _$ q; M2. 2%硝酸银内置暗处1小时
* f F, ], S" b; n' m3. 蒸馏水冲洗3次，再流水冲洗10分钟# K! w6 o" k' j: ~' y
4. 还原1小时（硫代硫酸钠5g，氢氧化钠0.2ml，蒸馏水100ml）
* E9 B5 [3 {' r* o) C5. 5%硫代硫酸钠1小时5 A, T+ E* |1 z! |5 w! P9 d
; |1 Q s% [4 }& K8 X
1.固定后的细胞爬片用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤2遍；. k" Y% v5 \1 H& K3 c
2.浸入5%（也有1％）硝酸银水溶液中10min，日光或紫外光曝晒10－45 min，蒸馏水洗涤；$ K8 z) d, ?- w
3.浸入5%次亚硫酸钠（3%硫代硫酸钠冲洗）溶液中，蒸馏水洗；
" n9 f: S! e% Z* l. z5 ?$ Q 4.1%中性红衬染1 min，水洗，晾干，酒精系列脱水（常规顺序：80％－90％－95％－100％1－100％2），二甲苯透明，中性树胶封片。
8 N& U" H$ J$ U* m2 I2 R 1. Sections to water. 切片脱蜡至水 4 ` m8 r% w$ [# N
2. Place sections in 1% silver nitrate solution under ultra- violet light for 45 minutes.
! |& m0 F8 F- `" h置于1％硝酸银溶液在紫外光下45分钟( o$ f0 T8 V, k) ]; l( O
3. Wash in distilled water. 蒸馏水漂洗
: z2 U$ Q9 Z( N2 l& H U4 Y4. Treat with 3% sodium thiosulphate for 5 minutes. 3％硫代硫酸钠处理5分钟6 \0 G+ s# i ^
5. Wash in water. 用水漂洗3 D. F, P+ v) M& h. h- }6 V
6. Counterstain with van Gieson for 5 minutes. Van Gieson复染5分钟% {8 t' K, ]! s
7. Wash in alcohol. 乙醇漂洗9 {8 V7 ?: P$ S6 t+ s+ n5 F
8. Clear . Mount sections in DPX 透明封片4 ]2 q# x% \+ P' y) T1 [& Q. w
结果：钙盐沉积区域呈黑色，背景红色.
1 O* A. k% S) I9 U% c8 ^" j( f+ _
A 组以现行报道方法染色:4 %多聚甲醛固定标本 ,
, \- M) h3 x/ \" `1 %硝酸银溶液紫外线下染色 10min ,0 ^# @; T+ I, G+ y
用 5 %硫代硫酸钠染色 2min ,+ A- i9 J! O+ M9 X& _8 i$ |
1 %中性红复染 10min ,$ s' x2 N7 ^; Z0 ~
酒精冲洗后观察。
# M: @4 `- J3 _3 y8 D( f! N, [' c$ g1 D1 P* b; j X5 G' A
B 组以改进的方法染色:
+ u; v) W- C- G( p# K- M) F 4 %多聚甲醛固定标本 ,
4 K7 H/ @1 o! E4 D$ U& b! \* n5 %硫代硫酸钠孵育 30min ,蒸馏水冲洗 7 e0 @0 B9 b+ c: b9 A( U: Q
,然后用1 %硝酸银溶液紫外线下染色 30min ," e3 q: d& r% u! [+ k' I, r
蒸馏水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质 ,
2 l# p7 @; C0 X8 I/ [% K继续用 5 %硫代硫酸钠染色 2min ,2 v( E8 p m7 ]
1 %中性红复染 10min ,蒸馏水漂洗后观察。% }( E- l: s6 @; ]) Z/ q" i
; j( e7 ^, e5 O! n( v4 ]+ t. {4 k
或取成骨诱导 21 d 的细胞, 体积分数为 0.95 的乙醇固定 15 min,
7 {6 B4 h, ~& U7 `& H10 g/L 茜素红 S 染液在室温下浸染 10 min,
" l; t- E. k0 c# u4 o: R去离子水洗涤3次,
' k+ j/ H* H* r/ @; D, I3 R V9 v倒置显微镜下观察。
% ^1 V: V4 P X* v; I二、茜素红染色/ q; ?1 e- c5 }
茜素红S0 T$ B% ]! k3 S/ h% Y
中文名称: 茜素红S英文名称:alizarin red S; sodium alizarin sulfonate
! N6 g0 G" q1 v/ E# ~/ A! VCAS: 130-22-3分子式: C14H7NaO7•H2O分子量: 360.28中文别名: 9,10-二氢-3,4-二羟基-9,10-二氧代-2-蒽磺酸单钠盐； 茜素红；（3） 茜素磺酸钠 ；茜素S ；酸性媒介茜素红；酸性媒介红S-80（Acid Mordnat Reds-80）；C. I.媒介红3（C. I. Mordant Red 3）。
- r# B8 t$ B6 J$ p性质：橙黄色的针状体。溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿和苯。1%水溶液pH2.15。由茜素经发烟硫酸磺化，然后转变为钠盐制得。茜素红能和许多金属离子生成稳定的红色络色物，在分析中常用作金属指示剂；光度法测定金属离子的显色剂；在分析中常用作金属指示剂；光度法测定金属离子的显色剂；酸碱指示剂，第一变色范围PH值3.7(黄)～5.2(紫)，第二变色范围PH值10.1(紫)～12.0(浅黄)；用于极谱法测定金属离子。8 v y9 h* H3 v) H7 Q3 b0 ]% m0 F
用途: 络合滴定指示剂和酸碱指示剂。9 R" @- d' k' Z$ H
配制：将托盘天平上称取0.1g茜素磺酸钠定溶于100ml蒸馏水中转移入滴瓶中，贴标签备用。 或用茜素红粉加PBS溶解后，要注意调节PH值到7.2！过滤就可以了。0.1%的茜素红Tris-HCL(PH8.3), Tris的浓度做分子生物学一样的，用0.1mol／L的HCI或0.1％的NaOH调节。
4 M g+ N' t7 }+ c9 r& f茜素红染液配方
- V- G( J8 b% v Q+ f$ c8 L6 R配方一 茜素红染液（Ⅰ）% R% W& X/ s8 A# p" @
取冰醋酸5毫升、甘油5毫升、1%水合氯醛60毫升混合。在这种混合液中方入少量茜素红，制成茜素红饱和溶液。
' C \1 ~+ p4 ?0 M5 R& W! D0 C配方二 茜素红溶液（Ⅱ）+ q& l1 R- r2 d, m/ w7 L1 K8 h
取1克茜素红，溶于100毫升95%酒精中，搅拌，然后跟900毫升1%氢氧化钾溶液相混，即成深紫色的茜素红染液
! ~/ \* K0 t( |/ a0 G?茜素红(Fluka)溶于96％乙醇中配成0.12％的茜素红液。
% }6 v2 G6 F0 t配方三- I/ a+ I. y9 m
0.1%的茜素红配Tris-HCL(PH8.0) ( ~7 ~ {" c& q. o3 h0 ~
具体配制方法――1g Tris（1g左右Tris均可）加入三蒸水100ml中，用滴管往配制液中加HCl（分析醇），一滴滴地加，边加边测试PH，待PH为8.3左右即可（无精密PH测试仪，用PH试纸也是一样的，但是要能测到8点几的PH试纸），配好后往里面加0.1g的茜素红，便得到0.1%茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)溶液。- B$ w6 Y9 k; E9 }+ U) V
茜素红染色步骤8 U% H5 y& T" c9 _. D0 R
1、弃培养基，培养皿用PBS冲洗2次，
5 O8 ?, ?, [; [3 ]* ~4 Y0 Q2、95% (也有90％)乙醇固定10－30min，蒸馏水冲洗3次
) S. X% W) d* V& w$ U. V3、 0.2% （or 0.1%）茜素红[茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)]染色,37℃,30min ,用清水冲洗。
- }! O: Q6 ~% x, V, o- A. I( z在低倍镜视野(4 ×10) 下进行矿化结节计数+ H- c0 c( |& ?( r6 j. V
+ k8 \( W# L- E6 H" r/ A4 X钙染色法—茜素红法
4 P u( {% h0 V* R$ o染色步骤
3 k+ U; K7 a1 Q& M: C' O1． 茜素红S染液5分钟
# y: G+ E+ ^& u( U+ _% g2． 用丙酮洗20分钟 , I3 B- d; ^- @4 Y. ^% P' l2 k
3． 丙酮：二甲苯（1：1）溶液20秒
3 J+ _" i8 i, F# w7 G4. 树胶封固
$ \% u* E2 Y5 t结果：钙累及物呈桔红色
, }" b5 O2 T% H0 S& p$ r2 C
# M% {1 y6 D& I' I. u9 m④Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色（成骨特有）7 U) r- h. l& v$ Y, ?) \/ m
取成骨诱导 7 d 的细胞爬片,磷酸盐缓冲液漂洗, 4 ℃ 丙酮固定 10 min, 磷酸 盐 缓 冲 液 洗 3 次 , 5 min/ 次 ; 体 积 分 数 为0.03 的过氧化氢孵育 10 min, 磷酸 盐 缓 冲 液洗 3 次, 5 min/ 次; 血清封闭液封闭 15 min, 倾去封闭液, 磷酸盐缓冲液稀释的Ⅰ型胶原Ⅰ抗 4 ℃ 过夜, 磷酸盐缓冲液洗 3 次, 5 min/ 次;兔抗羊Ⅱ抗室温 1 h, 磷酸盐缓冲液洗 3 次,5 min/ 次; 辣根酶标记的链霉素卵白素工作液室温 15 min, 磷酸盐缓冲液洗 3 次, 5 min/ 次,二氨基联苯胺显色, 自来水冲洗、复染、脱水、透明、封固。 |
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发表于 2009-3-24 11:08
发表于 2010-4-15 23:40
