|
- 积分
- 0
- 威望
- 0
- 包包
- 9
|
成骨诱导培养: 取第 3代细胞, 接种入含体积分数为
; {: n! [! q: T+ w& m. M" N0.1 的新生牛血清 、
$ X8 D8 s6 `" N; P0.1 μmol/L 地 塞 米 松 、
2 ~$ n2 s, k) }% f6 w6 W50 μmol/L 抗 坏 血酸 、
) w S7 f% I9 b ]* g10 mmol/L β- 甘 油 磷 酸 钠
8 j! M" `' v9 B# H! R的 高 糖 DMEM培养基进行成骨诱导培养, 进行形态观察、功能检测。间充质干细胞成骨特性检测:
5 h1 X. i5 C3 y5 J①碱性磷酸酶组织化学染色: 4 m) x, l+ W. b: f: O
取成骨诱导 14 d 的细 胞 , 40 g/L 中 性 甲 醛 固 定 15 min, Gomori改良钙钴法染色。取 5 块玻片, 每片随机取 2个视野, 采用网格计数法, 计算碱性磷酸酶染色 阳性细胞的百分比。/ L! r. \) H% g; U1 F
②碱性磷酸酶活性检测: 7 b; p( g5 g+ l K" T
取第 3 代细胞, 以 1×105/ 孔的密度接种于6 孔板中, 分别成骨诱导 3, 5, 7, 10, 12, 14 d,按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。/ A6 h( F! K; i6 e
③钙结节染色: 3 r6 \7 m4 F- R
Von Kossa’s矿化结节染色法
2 g0 t; @. D4 Z4 n9 y% y2 M3 N原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。, V, X% S0 l7 ^* I
Van kossa银染色法% `, X/ ] T' R3 g1 t
试剂：5 r! G" S a1 E* r; q
1．2%硝酸银水溶液：硝酸银2g蒸馏水加至100 ml。# O: _4 K4 [+ M& A# X- D7 ?
2．5%硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠5g，蒸馏水加至100 ml。
# ^. s1 w/ K5 J6 @7 y1 i1 t. J% k, l! c& E( a Y
培养皿用PBS冲2次，95%乙醇固定10分钟，蒸馏水冲洗3次! u& ?+ k& H! h @& q
2. 2%硝酸银内置暗处1小时
, ^6 b: p( }1 ~3 t# k- F. W( b0 }3. 蒸馏水冲洗3次，再流水冲洗10分钟0 x. q* p; ?7 B$ K
4. 还原1小时（硫代硫酸钠5g，氢氧化钠0.2ml，蒸馏水100ml）
4 a4 x& q8 s. p- x# k' r5. 5%硫代硫酸钠1小时. Z4 ]+ X# `- G
5 Q) V7 W& w1 W
1.固定后的细胞爬片用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤2遍；9 a. @( \7 p. `, H* h
2.浸入5%（也有1％）硝酸银水溶液中10min，日光或紫外光曝晒10－45 min，蒸馏水洗涤；. k6 a' Q4 b3 s& d E/ y A+ V" ~
3.浸入5%次亚硫酸钠（3%硫代硫酸钠冲洗）溶液中，蒸馏水洗；
# U" ~2 ?/ U0 y/ j 4.1%中性红衬染1 min，水洗，晾干，酒精系列脱水（常规顺序：80％－90％－95％－100％1－100％2），二甲苯透明，中性树胶封片。
$ e5 f+ r. H( I1 O 1. Sections to water. 切片脱蜡至水 : M8 g% f- M0 {
2. Place sections in 1% silver nitrate solution under ultra- violet light for 45 minutes.
, a, ~$ Q, N$ ]1 m0 J置于1％硝酸银溶液在紫外光下45分钟1 Q* @5 E% U* g$ I. {
3. Wash in distilled water. 蒸馏水漂洗
8 M0 f, B& h. C4 J4. Treat with 3% sodium thiosulphate for 5 minutes. 3％硫代硫酸钠处理5分钟
' Q$ S* c* B/ r. ~2 g# A# v3 b5. Wash in water. 用水漂洗' r# h7 f" ?* f {8 e: `( |
6. Counterstain with van Gieson for 5 minutes. Van Gieson复染5分钟
: @' {) a7 y$ i1 t s7. Wash in alcohol. 乙醇漂洗
0 Q# J2 f) c! |% s/ J* K8. Clear . Mount sections in DPX 透明封片
/ U3 Y% m$ _! }* O7 X 结果：钙盐沉积区域呈黑色，背景红色., C$ a6 ?3 I3 b; M
' A% a; w3 l5 o3 aA 组以现行报道方法染色:4 %多聚甲醛固定标本 ,
" V# Q. A$ W# ~! E0 [1 %硝酸银溶液紫外线下染色 10min ,
7 P* I# t7 C S3 h: X& W4 i0 J用 5 %硫代硫酸钠染色 2min ,) ^+ [, O. ~8 G% b
1 %中性红复染 10min ,/ |) v7 m+ `' o3 t! H
酒精冲洗后观察。8 C- q8 r0 L$ M" o5 e
8 O: R% H+ I4 Z0 N& g; _
B 组以改进的方法染色: k6 s0 |1 X+ S0 c, j' c
4 %多聚甲醛固定标本 ,! h1 \) h1 s- J2 [ m' q
5 %硫代硫酸钠孵育 30min ,蒸馏水冲洗 ; T9 P' }1 V! k, C) v$ A/ |
,然后用1 %硝酸银溶液紫外线下染色 30min ,$ H5 x8 d, O5 V; W. Q) a3 {% h" ~
蒸馏水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质 ,
+ L- K2 J0 u& M! Z7 L- Q继续用 5 %硫代硫酸钠染色 2min ,
1 R- w# A6 v: r0 U( D% I1 %中性红复染 10min ,蒸馏水漂洗后观察。4 _; z* r5 A; |3 b, J! E/ \' L
; A T* n& \7 m" S) I1 W' F) {; ?或取成骨诱导 21 d 的细胞, 体积分数为 0.95 的乙醇固定 15 min, 7 i; `8 m( i1 q. Q7 l
10 g/L 茜素红 S 染液在室温下浸染 10 min,
6 C8 t' i+ q& `/ j% h9 y去离子水洗涤3次, , f* U" O0 V: G- l( [9 \$ z; y
倒置显微镜下观察。8 U( f/ h7 p9 R
二、茜素红染色
$ A' y9 T4 y$ [茜素红S
2 |& [6 c7 K; b/ h( D4 K中文名称: 茜素红S英文名称:alizarin red S; sodium alizarin sulfonate% i, j8 A0 S% C F. ~
CAS: 130-22-3分子式: C14H7NaO7•H2O分子量: 360.28中文别名: 9,10-二氢-3,4-二羟基-9,10-二氧代-2-蒽磺酸单钠盐； 茜素红；（3） 茜素磺酸钠 ；茜素S ；酸性媒介茜素红；酸性媒介红S-80（Acid Mordnat Reds-80）；C. I.媒介红3（C. I. Mordant Red 3）。5 @4 v/ Z1 h9 x8 m4 t( O: L
性质：橙黄色的针状体。溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿和苯。1%水溶液pH2.15。由茜素经发烟硫酸磺化，然后转变为钠盐制得。茜素红能和许多金属离子生成稳定的红色络色物，在分析中常用作金属指示剂；光度法测定金属离子的显色剂；在分析中常用作金属指示剂；光度法测定金属离子的显色剂；酸碱指示剂，第一变色范围PH值3.7(黄)～5.2(紫)，第二变色范围PH值10.1(紫)～12.0(浅黄)；用于极谱法测定金属离子。1 d3 c7 Q5 {1 ]2 G
用途: 络合滴定指示剂和酸碱指示剂。. }# G1 |: ^" Q: ]; e
配制：将托盘天平上称取0.1g茜素磺酸钠定溶于100ml蒸馏水中转移入滴瓶中，贴标签备用。 或用茜素红粉加PBS溶解后，要注意调节PH值到7.2！过滤就可以了。0.1%的茜素红Tris-HCL(PH8.3), Tris的浓度做分子生物学一样的，用0.1mol／L的HCI或0.1％的NaOH调节。
+ U- Z: [4 m8 L0 N- ~5 M/ g7 E茜素红染液配方
$ `' [, p! P, ~* n配方一 茜素红染液（Ⅰ）( |3 O/ e4 N, f' C! Z' c, w
取冰醋酸5毫升、甘油5毫升、1%水合氯醛60毫升混合。在这种混合液中方入少量茜素红，制成茜素红饱和溶液。
: }2 T. B$ A8 `配方二 茜素红溶液（Ⅱ）, t) Q" {! q5 J3 C+ g% l% G
取1克茜素红，溶于100毫升95%酒精中，搅拌，然后跟900毫升1%氢氧化钾溶液相混，即成深紫色的茜素红染液+ V. J4 i+ L( ?+ Z2 w
?茜素红(Fluka)溶于96％乙醇中配成0.12％的茜素红液。
/ ]/ l) h" m3 d- k6 o8 d配方三, h9 s1 |' H9 ~5 R+ }, t4 g
0.1%的茜素红配Tris-HCL(PH8.0)
# ~ g) L/ U* f. o: o9 K+ V具体配制方法――1g Tris（1g左右Tris均可）加入三蒸水100ml中，用滴管往配制液中加HCl（分析醇），一滴滴地加，边加边测试PH，待PH为8.3左右即可（无精密PH测试仪，用PH试纸也是一样的，但是要能测到8点几的PH试纸），配好后往里面加0.1g的茜素红，便得到0.1%茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)溶液。 C/ D2 ?) ` v& d5 K6 N( M
茜素红染色步骤
# `! X' Y6 H( l7 B# R) K7 P$ b1、弃培养基，培养皿用PBS冲洗2次，; D" J# W1 o: h: r( ]* v. P: E3 A
2、95% (也有90％)乙醇固定10－30min，蒸馏水冲洗3次
% @, m5 ]/ `- `* k' ?$ V S3、 0.2% （or 0.1%）茜素红[茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)]染色,37℃,30min ,用清水冲洗。
; M3 v! s; Z# s2 H在低倍镜视野(4 ×10) 下进行矿化结节计数' U1 U# W2 o4 E9 v2 e
G! Y+ _! e! k, [
钙染色法—茜素红法 % S3 V% ^9 [5 _8 P$ c
染色步骤 # k8 z7 ~& }! q3 U- ] `
1． 茜素红S染液5分钟
3 ? P& @/ ~' R& N( \2． 用丙酮洗20分钟
5 i, l Q; H0 r7 V3． 丙酮：二甲苯（1：1）溶液20秒
9 w4 `/ B |0 H) G4. 树胶封固
4 H6 ~( M( A+ }( z* n" E4 i结果：钙累及物呈桔红色
7 Z i' C: v( o& g2 U7 M
. @5 `" J; h( e- G* I. R4 U④Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色（成骨特有）; U$ a9 ^3 \0 x! D
取成骨诱导 7 d 的细胞爬片,磷酸盐缓冲液漂洗, 4 ℃ 丙酮固定 10 min, 磷酸 盐 缓 冲 液 洗 3 次 , 5 min/ 次 ; 体 积 分 数 为0.03 的过氧化氢孵育 10 min, 磷酸 盐 缓 冲 液洗 3 次, 5 min/ 次; 血清封闭液封闭 15 min, 倾去封闭液, 磷酸盐缓冲液稀释的Ⅰ型胶原Ⅰ抗 4 ℃ 过夜, 磷酸盐缓冲液洗 3 次, 5 min/ 次;兔抗羊Ⅱ抗室温 1 h, 磷酸盐缓冲液洗 3 次,5 min/ 次; 辣根酶标记的链霉素卵白素工作液室温 15 min, 磷酸盐缓冲液洗 3 次, 5 min/ 次,二氨基联苯胺显色, 自来水冲洗、复染、脱水、透明、封固。 |
|
发表于 2009-3-24 11:08
发表于 2010-3-17 18:19
