求指导脂肪干细胞流式鉴定

weychui

各位大神们好，小弟第一次准备做流式，网上找了一些protocol，感觉好混乱，自己整理了一份，如下，请大神们指导有没有什么问题。多谢！8 d6 I# V; p8 k9 Y
1.倒去旧培养液，用PBS冲洗两遍，向培养瓶中加入胰酶消化2min，镜下观察细胞缩小，悬浮时，加入3mlFBS终止消化，转移至15ml离心管后离心1000rpm 10min,弃上清，用PBS重悬，再离心一次。
8 c. b# ~, @& O/ N2． 用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1-5X105/ml,收集约9X106个细胞，分装至9个流式管，分别加入抗大鼠1-CD44PE 、2-CD90FITC、3-CD29FITC、4-CD31FITC单抗各1 μL， 5-PE-IgG2a、6-FITC-IgG2a、7-FITC-IgG、8-FITC-IgG1为阴性对照。9-不加抗体空白对照一组。4 ℃避光孵育30 min。
9 b' G" W5 N3 R( I2 |8 p! N3.孵育后分别加1mlPBS,1000rpm离心5min，弃去上清，再加入1mlPBS，1000rpm离心5min，弃去上清。
9 q+ i( B$ G) V3 V& `4.加入500ulPBS重悬细胞，4℃避光保存，上机检测。. v- [& X' A1 X1 t
我有几个问题：1.调整好细胞浓度后将细胞转移到哪里再加入抗体反应？流式管？EP管？离心管？2.根据上面的步骤，最终流式管中的样本只有500ul？这样的话上机能检测出来吗？3.细胞调整浓度后又离心了，浓度还是会发生变化，那么调整细胞浓度的意义在哪里？请大神们指导，急！多谢！

ccst4838318

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) @# w9 }. u3 T4 @5 p+ H# |1.放到流式管中加抗体反应 2.只要细胞量在流式检测范围内是能检测出来的3.细胞调整浓度，是能让你更好的清洗细胞和计算细胞量，以便充分和抗体反应，上流式检测的话一般是按细胞量算的，太低检测不出来，如果检测10000个细胞的话，浓度很低那跑的时间就会相对较长，浓度太高可能堵孔或者出现假性结果

dollar007

步骤2，PBS重悬，因你分装9管，体积控制在400-500ul，比较适宜。
; h6 z' H1 y' E2 J步骤2：你的抗体加量，请根据试剂说明书添加。细胞量不足的话，可以根据比例减少抗体量。孵育时间，15-20分钟就够了。; l! s5 i0 c# J- [4 [* ]) t, {
上机前请过滤一次细胞（300目尼龙膜就可以），防止堵塞仪器6 q+ B0 o! c4 C# ]
检测时体积有500ul，可以。

cloudycity

( g! b6 c. L/ A$ w) J- V( C
, u) n( V9 C# p1 m5 {2 E- D
1.消化完细胞，用筛网过一遍，确保是单个细胞，一般我都是用的还有BSA的PBS来做。
0 S% ^% e# ^) Z' M- ^; G2.体系肯定是在流式的上样管弄了。
+ o" d3 B# X4 X% m8 O+ M3.调整浓度：一方面是量化、另一方面就是，每个抗体都会有说明的——一管抗体多少微升，可以运行多少test，1个test对应多少细胞量。一般孵育体系我都会控制在500ul。4℃孵育的时候，要时不时去晃匀，防止细胞沉降，导致结合不够充分。: J% y9 x2 f9 W
4.够了，检测不用很多的，一点点就行，检测够case就行了。如果细胞量太大，可以适当提高，防止堵塞，假阳，这个没什么死模式。

colins

步骤二：你可以现在相应的流式管内加入抗体，然后加入细胞，（细胞量足够的话，建议浓度调整到1X106/ml，且保证每个流式管内的细胞量控制在1X105）；+ W) z, v9 t- A$ T9 D7 Q
步骤四：我认为按你的做法，最终控制到500ul体积的话，样本浓度太低，你上流式细胞仪的时候，估计速度回很慢，不如按我说的将浓度调高一些，最好能使上机时候的速度控制在500-600个/s；& j8 y, U1 O4 m4 P9 _$ G
至于你的问题3，初始的时候调整细胞浓度主要是为了保证在细胞上机时有合适的浓度，至于由于离心损耗的细胞对于本实验来说可以忽略了

相宜

分享个人经验：1.我的脂肪干细胞取得是第三代的，0.25%胰蛋白酶脱壁后用FBS中和胰蛋白酶，用细胞计数板线先进行计数，然后分装入EP管，密度为1x10的6次方，避光锡箔纸封口。2 我是提前联系的郑大一附院血液内科实验室的老师，之前告诉检测的老师我需要测得分别是 CD34，CD105，CD29，CD31，还有IgE，记得当时测定了9个，具体见我之间发过的帖子。分别加入1ul的抗体试剂，上机检测，然后得出几个不同的曲线图。分析阳性率，从而去分析有几个指标符合脂肪干细胞的指正。个人建议：如果单纯为了鉴定而做，自己查阅文献了解过程即可，现在三甲医院检验科都有流式细胞仪，抗原抗体试剂相对也比较齐全，这样你可以让检验科的老师帮你去做，会大大节约实验的财力成本和精力，他们常年做细胞分析，相对出图和数据都比我们偶尔做一两次要专业的多。这样建议并不是违背科学实验的精神，而是我们通过一种更简便快捷的方式有专业人员帮我们做出更为精准有效的数据。个人拙见，仅供参考。

相宜

那时候我们实验条件有效，最初我们连做流式一个EP管应该装多少细胞都不太清楚，还是检验科的老师指导我们对细胞进行计数，分装。也就是那个时候学会了用细胞计数板，学会了操作流式细胞仪，你也可以多请教检验科的老师们哦 他们会教你一些很多很多的细节，这些都是书本上没有的。