求指导脂肪干细胞流式鉴定

weychui

各位大神们好，小弟第一次准备做流式，网上找了一些protocol，感觉好混乱，自己整理了一份，如下，请大神们指导有没有什么问题。多谢！4 \! O' _; E" Q/ @+ \
1.倒去旧培养液，用PBS冲洗两遍，向培养瓶中加入胰酶消化2min，镜下观察细胞缩小，悬浮时，加入3mlFBS终止消化，转移至15ml离心管后离心1000rpm 10min,弃上清，用PBS重悬，再离心一次。
1 T) E4 m8 E" m; M2． 用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1-5X105/ml,收集约9X106个细胞，分装至9个流式管，分别加入抗大鼠1-CD44PE 、2-CD90FITC、3-CD29FITC、4-CD31FITC单抗各1 μL， 5-PE-IgG2a、6-FITC-IgG2a、7-FITC-IgG、8-FITC-IgG1为阴性对照。9-不加抗体空白对照一组。4 ℃避光孵育30 min。
9 E% g& u* V7 r6 z3.孵育后分别加1mlPBS,1000rpm离心5min，弃去上清，再加入1mlPBS，1000rpm离心5min，弃去上清。
6 ]) p$ ~  h5 u( h4.加入500ulPBS重悬细胞，4℃避光保存，上机检测。
& `. j  ^( L! O) w) y我有几个问题：1.调整好细胞浓度后将细胞转移到哪里再加入抗体反应？流式管？EP管？离心管？2.根据上面的步骤，最终流式管中的样本只有500ul？这样的话上机能检测出来吗？3.细胞调整浓度后又离心了，浓度还是会发生变化，那么调整细胞浓度的意义在哪里？请大神们指导，急！多谢！