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初来宝地，贡献一些资料和大家分享，感谢这个好网站
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前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了 很多次，不过很快改善了 实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，结合丁香园战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 c- V9 ?; ^) ?8 X6 f
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，; h* q" s T6 d; D* _5 [+ M& w
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双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。6 T$ c8 C6 C9 c# j
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒& X+ ]/ R1 t8 x3 w/ F
酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。
! m# L& l# V) z1 p, D% Y2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接3 ]: s5 s+ i: h3 d9 Y
摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
. F: q, v! t8 H/ k7 t) L0 h$ i" [+ Vpmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为" E) m( q7 P! w& y) h: _ |
0.03×5.38×0.66=0.106524µg。) h9 `1 h0 A+ i# r8 T
测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。' G' X, I3 p- o1 J
连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。
7 y& O1 J2 M/ W3、转化：+ O* W- A, v" P: M4 f3 i
a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 , @, f5 @! w; d4 t6 G$ z6 K6 D1 Q
b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
) R6 `" }, K" z# C. Z) Vc、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。
( ^9 |3 m- X1 B# j* u* E取100μl铺板。也可离心后余100μl
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几个非常重要的问题
* R. V* M: J1 R5 T8 m1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度. T3 q3 y. ^: y
2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干; }. b8 O' E" e7 a6 b; ^! p
3对照的设立：: t2 c6 p" h- j$ Q/ n. F. P' Z
为验证双酶切是否成功,可做如下对照:
! G8 a3 z0 q" l) S0 LA 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功. : e3 ^4 d6 r! ^) A* |- ]( E% B6 J6 T
做转化时,也要进行对照. ' I) M* z$ A1 J3 B( v+ Y; C2 q
设4个:! H1 v4 u3 |* }3 u/ ?
A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下. F5 ]- |( O; r7 H
B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒6 C6 i: X- {( _% n6 x
C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.& G( @/ ~ R2 e; A8 ~
D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.
, Y2 n h6 |* y4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。& C& i3 f3 E- S* H( g c4 q# n
经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的 挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。。。。。。 |
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发表于 2009-3-30 11:16
发表于 2009-11-6 19:29
