好文章：实验室中PCR引物设计所要关注的黄金法则 - 实验室综合讨论区干细胞之家



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发表于 2009-3-31 15:50 |只看该作者 |正序浏览 |打印

自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生物学研
究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不
合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚* n* t. v: L0 z7 w/ Q) d0 U  e$ p3 ^# O
体带），不出带或出带很弱，等等。0 R5 D4 y, O" i$ r" z
现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得8 R8 \- o+ \0 x* r
到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR8 J+ z' a9 |( A- X7 ?& v4 Z1 `
引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件
使用问题进行探讨。
8 v  S) A' [4 b1 t) ^0 c$ m

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 . g5 x2 b& p$ P6 o! h) W
　　DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
0 T" j  h7 J/ X7 s7 H
　　2.引物长度一般在15~30碱基之间。3 b9 T- b! ~! c- ^! C# u' j
! z: X4 ]1 B7 C
　　引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
$ L* a! u  b. t
　　3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。& H3 j( Z" ]9 d( v, E

　　GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

　　4.引物3′端要避开密码子的第3位。

　　如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。2 x* H9 B1 Z! |  T* a

　　5.引物3′端不能选择A，最好选择T。

　　引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

　　6.碱基要随机分布。+ v6 r2 s) b% D$ u; G
, ~$ I: t6 z% k4 \! _4 u3 F$ w
　　引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

　　7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
9 q; p7 J3 S: U; _3 z8 ]
　　引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。

　　两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

　　引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。! T! ~+ N4 g5 v5 O. X6 ~& L1 W

　　8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。1 K0 H: G3 m% v8 c, N- N( ^# a, R
3 j9 P9 J& \. S. ~. F* `
　　△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）$ M& i! l9 B% ?; b5 T" P1 K

　　9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。% U: ]- `6 [! r! s9 n
5 e. F7 c) o8 j9 y
　　引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

　　引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。8 B) V; m5 y! p

　　10.扩增产物的单链不能形成二级结构。: I9 l9 l. D, R, }$ f

　　某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。1 n; L" v% {4 H
( g( B" ^5 z' N- ~; \
　　11.引物应具有特异性。
1 ^( V8 R6 t# X* b+ ^4 h. o( \
　　引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。% J" B$ ^3 `8 a6 h. b
7 b9 ^3 o- o  m
　　值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。& g7 d2 ~1 @4 o" z0 @7 p% s. v* G- N

　　做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：7 N! T6 N% V$ O, _, k1 Q. q4 h
7 A0 U8 t" {) M8 @+ e* e, I4 R0 P
　　1)避免重复碱基，尤其是G.
) \4 |9 I* d* I7 R* c8 q4 S
　　2)Tm=58-60度。

　　3）GC=30-80%.9 b  Y/ }2 b! J$ F

　　4)3"端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
! u* b! A# t/ v" B, W2 }' i4 v5 l0 c
　　5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
5 d% X0 V& b* w- R
　　6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150bp最为合适（可以延长至300bp）。/ d; s0 y; v+ k. q0 m

　　7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；
) g! q5 Q0 W/ f  T" g% [- G' @
　　要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。0 t5 C: r6 ^$ ~) R1 _9 A2 }; y

　　而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

　　至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。
; [3 X" [1 D: v; @/ B0 q
　　做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。! g1 Z3 x& R" ^2 x' W% n

　　关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。