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自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生物学研* x- N, Q9 U: P
究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不
% k4 l8 T6 v7 K9 R: R合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚! I: |. }! g& T5 G
体带），不出带或出带很弱，等等。
4 O2 u2 L, q) k& d% ]9 I g现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得
4 ]! P4 \6 a- G* L3 p8 S到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR
& D+ O" J) U' U* C3 G引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件
# j0 y* N! g- F9 B- d4 [$ Z" o0 f7 d使用问题进行探讨。
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: \; {, A" T, k2 Q# t: k6 `: f* d9 w
q9 N* [+ w- \$ N( J0 q( W1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
) w; @% f/ I: ~9 @$ e, J; V+ e$ } DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
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2.引物长度一般在15~30碱基之间。8 o% k4 p9 v+ z
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引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。' e1 p7 v6 `4 q+ X3 _- T
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3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。$ h8 S4 M$ F# v
# S1 O4 P' o, u& y* Z, `$ J, ` GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
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r0 Z4 X" m5 f 4.引物3′端要避开密码子的第3位。
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3 N; O- o% G; z! t9 P0 `7 w9 u 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
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4 ^1 o% }- |4 T$ i# k0 g. _ 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。( r; T; W! ]" s5 ?
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引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
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5 ?+ G( Q: A' V1 e9 X 6.碱基要随机分布。$ o2 ]: g2 k4 ~4 Y: J; X
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引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
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2 z" I' \! v5 K) m 7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
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( V* l# Y( J) L! w; [) E 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。/ f; t6 W5 J' S# T$ W
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两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。
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引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。/ _7 u* W: n4 e, t
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8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。 R+ y' o) E4 p5 x
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△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）
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9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
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引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
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引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。
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5 I6 D1 D, [+ r' J2 P9 _+ x 10.扩增产物的单链不能形成二级结构。
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某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
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7 }6 V4 ~# T/ p+ g% A0 Y3 o 11.引物应具有特异性。
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引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。; ?( Q! i' D5 W
, S$ T+ b/ r2 D/ F- g8 g
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
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做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：9 w9 d! J" V J; }/ m2 w2 A
+ C& J1 f% J; X3 y! m5 W4 y' u, m- J 1)避免重复碱基，尤其是G.7 C$ J$ K9 r, X" o, {' ?8 `6 z
" }9 v, P0 g) O' H 2)Tm=58-60度。" J, T0 z- b$ @4 ~
, c3 t8 S' b6 J0 v5 ? 3）GC=30-80%.* y+ l( j# R2 ~: i/ M) o
) [( }9 U: c9 T' L0 [; ^' j% O+ f. E
4)3"端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.) w/ g' O7 `9 m% {3 H. I6 E6 O
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5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
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6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150bp最为合适（可以延长至300bp）。
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% n; ?" y6 u; Z; r* B+ }/ s4 C$ ?0 A 7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；
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, |1 W" i% ^- h* o& K1 T 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
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4 H" {' c _9 Q6 ^ 而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。7 ^' T7 o/ n& m% ^3 C
- E5 t$ B/ {& ] 至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。
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; T2 h% q3 w# D$ X# p# z0 R# K 做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。
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k# }& m. `' ]2 R( U/ e 关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。 |
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发表于 2009-3-31 15:50
发表于 2009-6-13 13:07
