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首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。7 {0 G7 Q* n C' j/ X, K8 f% S
大致培养过程：
% `& [8 z3 q: ~0 K/ w8 fD0
9 X$ g# D. N" B( A% X+ g/ r0 F1 ^用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。9 f% v4 F4 c0 H. T
培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。
1 m( k% C; g$ ^D3
) q, }7 |- _4 i5 W F( J- X! q" w对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml- W$ k) Y# g* |4 e; {
D6-D17
- B# U6 `5 ^9 f$ e1 A8 N2 ^每隔两天计数并调整密度为200万/ml
% d; t3 s9 D; I' ZD17
- o$ s" m5 d+ [+ [. ^1 \8 z/ H收集细胞并表型检测。+ G0 b3 b! i% ]; q0 U) z, Y
此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。- a. `) i3 q" x2 f" k" B6 @
% u. P- d! g/ R$ I另外再分享一下开发NK工艺的经验
* O4 K& l: r4 p5 x# r( z) V1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。 x- \ s4 Z* j, I0 t1 J
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。( }$ K+ q6 v% [! I
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。
. I- M& @% U, h1 s9 K( y! d$ \: A* a! I, K1 e3 z
以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
, a9 G0 Q- L" ]# Z$ F* n% g另外对NK培养提几点经验：
* C, h3 K9 B6 s- {- Z1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。" I, G0 p4 J9 X- R2 U
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好3 \6 H8 [; g: @% u; R9 R* U
3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。
) I- B" S( F, l1 [7 ^4 m* T4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
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发表于 2015-4-29 22:16
