|
- 积分
- 224
- 威望
- 224
- 包包
- 797
|
首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
9 I" n- r; Z+ @0 M8 _5 W大致培养过程：
9 @; K" G' Q! v6 Y( ^' ` ID00 `# |0 \" `' S7 g: v; K) Z
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。( f, D6 B* _. A7 _4 ~# c5 ~$ {
培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。
1 r; f3 x* I0 K* w BD30 F$ \0 u2 v- B
对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml- l, b' p* o2 H: [' ~ s. ~7 V
D6-D17
( i) T/ L, o s/ B" v5 C( Y/ k每隔两天计数并调整密度为200万/ml4 y8 F. d, l" ^- w4 D1 {- r' x
D170 o" S8 i0 L, J6 k7 Q1 R: {2 J
收集细胞并表型检测。; h, z, m0 [4 {5 a2 L" W! J. E
此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
& V1 A! t3 D! e9 e# @3 v' a7 w d+ k* f
另外再分享一下开发NK工艺的经验0 y6 r8 e: d$ R% a/ ]5 O
1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。4 p* s! w# N7 |( t: u+ j
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。
$ M I1 j* p# e4 ~2 w3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。
+ f8 E' T6 \" M! Y5 a9 q/ ~& `6 m
以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。7 H, n! R) g# Q
另外对NK培养提几点经验：
2 g& _" d3 k- M( ^! A% F9 M1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。 s3 Y/ y3 H. y8 C! O; W- p
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好
/ ]3 y! @5 G8 Y V- B4 B+ m0 Q3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。# h1 s3 K6 J- q* m( T
4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
-
总评分: 威望 + 34
包包 + 60
查看全部评分
|
发表于 2015-4-29 22:16
