个人关于NK细胞培养的经验分享及见解

chenlin080102

首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
( m, I3 `9 a' K4 \$ `% p& m大致培养过程：
6 U+ s2 w; h6 j. c0 k% ND0; ~7 D' b! |) ?/ L$ [; {
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
4 o. ]" W7 [$ ], k7 [/ u& W培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。
1 M' V0 Z" a6 K* I% z+ vD3
' ]& K6 P$ n! h' E3 y) s. C对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml/ d: h/ E3 J3 y& g* E
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每隔两天计数并调整密度为200万/ml4 f8 o- c( f- Q/ `1 h8 h, ~) d$ R' l
D17
4 s4 p8 O# s& j$ `! c收集细胞并表型检测。1 q8 J& e: T2 i
此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。& x6 l6 D! p4 o; H
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另外再分享一下开发NK工艺的经验4 l/ }: ~; y0 f. d% W5 l/ v9 E4 Q  E
1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。
* \2 C4 ?- P. j8 F" e# F2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。
9 N6 B( a# O  B; u2 H3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。' j3 t& r5 Z* t- D, O# Y3 v. t6 N+ F

% l6 M4 b% c9 c" [1 v# E& C! ?+ M3 k以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
9 g0 }' Y$ w' t5 f2 M+ j- e" O$ ?另外对NK培养提几点经验：
' F* w$ Q1 ~; C+ l8 h/ N1 B1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。
5 p7 g$ _  q8 r7 O4 x2 H2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好# A! f; Y' X6 X/ y6 j. p
3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。2 K2 H+ X' S; Q% j
4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。

cg001

不错，这个对于NK细胞的培养是有指导意义

暖羊羊

回复 chenlin080102 的帖子' V9 `1 e' U. I% `) q  v

+ c" E; V4 w' I5 n8 }, b) e/ _- e楼主的意思是  不加扩增剂（基因改造的K562），只加刺激、扩增因子即可在17d达到扩增120倍的结果？这很好呀，可以弱弱的问扩增因子除了白介素类得还有什么吗？如果不方便说具体的，可以说功能，我们自己摸索，最近实验室也想尝试不用滋养细胞培养的方法。

chenlin080102

回复 暖羊羊 的帖子# |5 w( V( |: M) _: [

8 K; ?, Q) G& h! Z/ v/ |- p" ]可以选择添加一些临床用药作为刺激佐剂，跟免疫功能相关的药物

syj7888

NK细胞用白介素21刺激不是更好吗？不过需要太多，所以成本增加很多，太贵，所以才会用K562方法

lunyuyuanxj

曾经做过一组实验，纯度能达到50%以上，数量也不少，具体记不清了，但重复试验时效果不理想

yanglixia1984

什么是激活剂 什么是扩增剂？D3天只加了扩增剂，什么时候添加激活剂呢

chenlin080102

回复 syj7888 的帖子% ]; C7 I( I! W- N; o3 X9 D/ w/ P
9 N/ {5 A3 H: {; u5 {
尝试过IL21对NK培养的效果并不是很理想，单纯依靠这些白介素是很难在数量和纯度上都达到理想效果的，如果使用IL21的话生产成本就会很高。

chenlin080102

回复 lunyuyuanxj 的帖子- k. q9 ~8 P9 J2 B& d% C7 l6 P

& f% @; C% b' l这应该是个体差异的个例吧

shellyanlanlan

学习了