|
- 积分
- 224
- 威望
- 224
- 包包
- 797
|
 
首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
% W4 t: [% F5 m. m大致培养过程：
5 H0 j* ^: g) ]) o4 rD0
/ x3 y% l& U, x% ]& `0 c用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
# R8 X- d/ `; H; ~培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。4 d. h/ s0 j: A- G" x, ]% k
D38 ~6 J# H0 P5 b. Y' j$ m2 `
对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml$ a9 s/ j+ H' C9 J; d6 |
D6-D17
9 a, F' l. T) U+ A每隔两天计数并调整密度为200万/ml
% ?1 \) `% b9 {1 X6 QD17$ y1 S" I, F3 T: d5 l
收集细胞并表型检测。) F( p2 i1 l. m
此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
3 E5 E, `7 E& b0 b1 f/ d3 d3 {, k& ^% U8 v x! h f
另外再分享一下开发NK工艺的经验
. e# n# |4 T& u: X+ V1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。, U R8 R' p* a9 P
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。# Z- G. y7 |( i- G5 L* p
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。
) X( o0 |3 v+ K: u8 m7 n% T! c; }; ?0 ^& d( L3 |
以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。 D# m# `/ {* ~" d6 [
另外对NK培养提几点经验：
|. h7 V( i7 O$ K A! H8 u; {1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。0 ` x4 Y# e: @8 |$ C8 I
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好
; L2 c2 Y& d1 _; X5 z1 k9 o3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。
* J$ Z* W- g* J) ~" Z4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
-
总评分: 威望 + 34
包包 + 60
查看全部评分
|
发表于 2015-4-29 22:16
