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首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
. J8 F. s3 h" d3 K大致培养过程：! L6 @% o) W& r! N% ?2 y7 a
D0
N Y. E W0 H, W用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。2 s; C, I% h( s
培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。
5 y, V5 Q; L: \' h! l' U6 d& e4 [D3
! `. `& }5 Z/ q$ F2 ]对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml, e7 K; U; y h# ~6 R l
D6-D17
; F1 J4 p. r; \$ t0 S) x |每隔两天计数并调整密度为200万/ml$ \# X N% h7 A, E6 q8 a# Z7 f
D17
1 A4 q+ E* V) F7 a收集细胞并表型检测。
. c, S6 E, E' i0 N8 q, P此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。; \1 q: w- p( Z' o% S) W6 @
! Q+ M9 t8 J5 v0 W i( e另外再分享一下开发NK工艺的经验) k, E, P( ]1 R1 d; O$ w* O/ \
1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。
6 x& \. `8 O) A2 \- S2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。
) S6 G& ?( L# q2 z3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。
1 W: p! H4 f" g! p1 c# z2 I
. p9 \+ d; G8 D6 \* L8 t$ v以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
) I. M( v" R+ v另外对NK培养提几点经验：
# \ P' p1 P$ s1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。
9 C0 \; z k; O) l: t! W, R1 {9 T2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好
& D9 u" S( B" q6 `6 O3 V) @2 ~+ S3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。
3 q% G" A: ]' g/ \, y8 H4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
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发表于 2015-4-29 22:16
