求助，关于脐带间充质死活爬不出来...

听不到

取了3根脐带，去完血管后剪碎贴壁处理，养了大概20天了，镜下看是这样的，感觉都能看见细胞了，但是就是没爬出来，哭了都要，3根脐带应该也不存在哪个脐带有问题的事啊。求帮忙分析下原因以及解决方法

chimo100

你应该把用的什么试剂，操作方法写清楚了，别人才能帮你分析啊

levell

1、剪脐带的时候要把上面有一层筋膜撕掉再剪，尽量剪成1mm3的组织块
% E% ?. B3 b* k6 S' d2、如果能消化一下效果肯定更好

journey07314

操作步骤最好写清楚点。一般贴壁培养后7天左右一次换液，14天二次换液的时候细胞差不多都爬出来了。

zxkll

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0 U9 @5 i2 A$ Hmark一下
  `# H2 @) }/ H9 M4 T0 @9 c前来学习

听不到

操作步骤就是正常的去三条血管，剪碎后于玻璃瓶中倒置过夜，第二天正过来并加入培养液（DMEM+10%FBS+1%双抗），然后就基本上是过个2，3天换一次液。但是到现在都爬不出来。以前我也不去羊膜，但是长得就挺好，快的7天就爬出来了，但这次死活长不出来。至于酶消化，我从来就没成功过...我是用1mg/ml的I型胶原酶，将去完血管并剪碎的组织块进行酶消化，37度轻摇消化，3,4h以及过夜我都试过，胶原酶消化完之后加胰酶在消化半小时我也试过，但还是收不到细胞，现在快要被细胞逼疯了。实验方案一大堆，但是没有细胞啥都做不了

baicaikua

一般会将华通氏胶剪成肉糜状，然后混合培养基放在培养箱里就好了啊。没什么特殊的，样上后就轻易不要动了。7天后将培养皿略倾斜，洗出培养基，在缓慢加入新培养基。感觉关键点是间充质干细胞是贴壁生长的，所以组织块要贴在培养皿上，不要频繁晃动，要是把组织块晃的漂起来会影响细胞爬出的速度。至于培养基没什么太大的要求，最基本的培养基就可以养，比如DMEM/DMEM-F12/1640什么的都可以养的出来。' V- a( W2 c. k
       总结：组织块能剪多碎就剪多碎。如果需要可将组织块均匀放于培养皿上1~2小时等与培养皿黏牢后再缓慢加入，不要使组织块漂浮，（可以相像水里的暗礁那样）又或者可以用少量FBS先铺板再加组织块（放置组织块飘起），然后再加培养基，一切加好后放培养箱里。一周后再换液，动作轻柔缓慢。一般两周可以出细胞了，最多3周吧。还有加双抗影响细胞的长出速度。还有看你第二张图好像细胞出来了啊。
+ o* m: B2 N4 v$ O* {* ^7 q' _& z       如果以前的细胞都长得出来就这次的长不出来，正常只有两个可能，培养基和组织块的问题。
7 L4 X- c; y0 c7 A       1. 培养基是成品还是用粉剂自己配的。成品的话是不是过期了，保存是否得当，粉剂的话除了过期和保存的问题，PH调好了么？
" P0 p: N6 f/ J0 {  p* h' e       2. 组织块是新鲜的还是冻存的，会不会冻坏了？冻存过的组织块就算是好的，爬出的速度也比新鲜的慢大约一周左右的样子。
* @* t; Z, R7 `2 S* A! R      

baicaikua

补充下你用胶原酶消化的话3~4小时时间实在是太长了。过夜的话一般是冷消化。但是就我的很多实验结果看来，冷消化用处不大。

journey07314

组织贴壁到你加培养基的时间稍长，我们一般是倒置贴壁两个小时左右就加培养基了。

听不到

回复 journey07314 的帖子  A8 o  `- L& W& N8 K

' r4 x& `# d7 D) @; M6 U6 e但我在剪碎组织的时候是把组织浸在培养液里的，所以没加培养液就过夜了。而且重点是我之前这样做长出来的细胞很好的，不知道这次为啥就不行了