关于T7E1 Assay的一个疑问

Damon-Salvatore

在网页上看到T7E1 Assay，是用来检测cas9介导的外源基因有没有插入到基因组（动物细胞）相应位置。
$ [7 d! A$ ^% n- }' P0 |4 i具体protocol见 http://www.tools-biotech.com/image/2014/05/27/20140527101154.pdf8 w1 V9 |4 _! h& ~, ^

4 @$ r/ E/ }1 y如果筛选的某个细胞克隆是杂合子（一个染色体上插入成功了，另外一个没有），最后结果也会出现两条目的条带，和纯合子一样，即最后还是需要测序确认。
7 L- z) C5 j7 ]1 \2 u7 q如此一来，直接通过PCR检测岂不是更高效（一个引物在插入的外源基因序列中，另外一个引物在上游或者下游四五百bp处，有条带的话就去测序）？
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还请大家多多指点。

Damon-Salvatore

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感觉T7E1 Assay没有办法鉴定KO是单敲还是双敲。但是如果用PCR检测的话，扩增引物在敲除区间外，拿产物测序，一比对就看出来是否敲除了，敲除区间如果是双峰（一个是WT），那就是单敲了。至于KI，用PCR（下游引物放在外源基因上，上游引物放在外源基因上游400bp左右），拿产物测序，也可以比对出是否插入，纯合子还是 杂合子。那T7E1 Assay岂不是费时费力结果还不好？

Damon-Salvatore

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2 b8 |1 X4 ^' l+ s& {( W原来如此 多谢指点